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目的:在先前的研究中,发现重组灵芝免疫调节蛋白(recombinant Ganoderma lucidum immunoregulatory protein,rLZ-8)可促进小鼠骨髓造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)的自我更新,并促进其向髓系祖细胞(Common myeloid progenitor cells,CMPs)及粒系-巨噬系祖细胞(Granulocyte and macrophage progenitor cells,GMPs)等粒细胞前体细胞分化。同时通过调节趋化因子受体4-趋化因子基质细胞衍生因子-1轴(CXC chemokine receptor type 4-Stromal cell derived factor-1,CXCR4-SDF1)促进成熟中性粒细胞从骨髓池释放至外周循环,进而实现小鼠模型中环磷酰胺引起的中性粒细胞减少症的治疗。为进一步完善rLZ-8在此病症中的治疗效果和作用机制,参考临床治疗中以粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)和聚乙二醇化重组粒细胞集落刺激因子(Peg G-CSF)为主要药物的用药方案,需要对多治疗周期条件下rLZ-8治疗效果的持续性及稳定性进行评测;同时,作为已经被美国FDA批准进行I期临床试验的测试物,在非人类灵长类动物模型中评估此蛋白在白细胞减少症治疗中对外周循环血液环境的作用将极具指导意义。此外,在已经确定了小鼠骨髓来源造血干细胞是rLZ-8主要的作用细胞后,筛选出其在细胞表面的结合受体对于完善rLZ-8在环磷酰胺引起的白细胞减少症治疗中的作用机制至关重要。方法:首先,设计并构建高表达rLZ-8的毕赤酵母工程菌株,完善rLZ-8的发酵和纯化工艺以获得高纯度的活性蛋白用于下游实验;随后,建立稳定的小鼠及食蟹猴白细胞减少症模型,在小鼠模型中,以Peg G-CSF和G-CSF为对照药物,测试rLZ-8在多周期给药中治疗的有效性和稳定性,在食蟹猴模型中测试rLZ-8皮下和尾静脉两种给药方式对外周循环血细胞稳态的影响,评估rLZ-8在非人类灵长类动物模型中的生白作用;最后,基于TriCEPS活细胞表面受体识别鉴定技术,在鼠源造血干细胞表面筛选与rLZ-8结合的受体并进行验证,以完善rLZ-8在环磷酰胺引起的白细胞减少症治疗中的作用机制。结果:第一部分研究中,首先设计并构建了rLZ-8高表达菌株,随后在中试水平发酵培养了该工程毕赤酵母菌株,同时通过基于阳离子交换色谱和凝胶色谱的精细纯化技术,获得了高纯度的重组灵芝免疫调节蛋白,为下游实验提供了性状稳定的高质量重组蛋白样品。第二部分研究中,首先构建了稳定的小鼠白细胞减少症模型及食蟹猴白细胞减少症模型,在小鼠模型测试了多周期治疗中rLZ-8对外周循环血细胞的作用,确认了中性粒细胞是主要的效应细胞,同时相比Peg G-CSF、G-CSF治疗组,rLZ-8的促粒细胞数目增长效果稳定平缓,具有明显的剂量相关性,达到了持续维系外周循环处于稳态的作用。随后,在食蟹猴模型中,确认了在非人类灵长类动物白细胞减少症模型中,通过皮下注射rLZ-8同样具有升高外周循环中性粒细胞的作用。第三部分研究中,首先确认了rLZ-8可以与TriCEPS进行偶联,并优化了偶联的条件;随后,应用免疫磁柱分离出纯度较高的造血干细胞,使用偶联后的TriCEPS-rLZ-8去捕获及富集细胞表面潜在的可与rLZ-8结合的蛋白,并通过蛋白质组学进行鉴定及相对定量,与对照组进行比较,得到与rLZ-8在鼠源造血干细胞表面结合的候选物;最后基于免疫荧光技术进行验证,认为CSF1R是rLZ-8的受体之一。结论:研究证明CSF1R为rLZ-8在鼠源造血干细胞表面结合的受体,多治疗周期内,rLZ-8在小鼠白细胞减少症模型的治疗中具有良好的持续性及稳定性,中性粒细胞是主要的效应细胞,同时对外周循环血小板具有一定的恢复作用,再次证明rLZ-8相比G-CSF类细胞因子作用在更原始的细胞上,骨髓细胞储备种类更丰富,可以应对多次环磷酰胺给药造模引起的骨髓抑制,同时在食蟹猴白细胞减少症模型中皮下进行rLZ-8给药具有促中性粒细胞生成的作用。目前尚未有报道同时具有抗肿瘤作用及维系血细胞稳态作用的蛋白质,rLZ-8在化学疗法诱发的白细胞/中性粒细胞减少症的治疗中,具有可能成为治疗/预防肿瘤治疗过程中中性粒细胞减少的治疗药物或补充剂,以及干细胞体外动员及扩增的佐剂。