角膜疾病是全球主要的致盲性眼病,其中角膜内皮功能障碍会导致严重的不可逆的视力损害。目前唯一的解决方法是角膜移植。然而,由于世界范围内的供体角膜缺乏,很多角膜盲患者不能得到及时有效的治疗。在我国,每年有超过30万的患者等待角膜移植,但是因为角膜供体远远不能满足需要,仅有约1%的患者能够得到手术治疗。近几十年来,再生医学(regenerative medicine)和组织工程学(tissue engineering)有了长足发展和深入研究。将培养的角膜细胞接种于生物支架材料上从而构建与天然角膜具有相似结构和功能的角膜替代物已经不再是构想。传统的依赖于供体的角膜移植将被创新而有效的方法取代。但无论是全层角膜移植或者角膜内皮移植,作为构建组织工程角膜的关键成分之一,足够数量的功能性种子细胞是必不可少的。人角膜内皮细胞(Human corneal endothelial cells,HCEC)是目前最理想的种子细胞,但其来源极其有限,体内不能再生,损伤后只能靠邻近细胞扩大和延伸来修复损伤,原代培养的人角膜内皮细胞增殖能力弱,体外经数次传代后不能维持其正常的细胞形态和功能,从而限制了其临床应用。近年来,将其他组织来源的干细胞诱导分化为角膜内皮样细胞成为研究的热点,通过不懈的努力和探索,我们已经创建了体外角膜内皮样细胞分化的诱导方法,其中包括神经嵴细胞、胚胎干细胞等。但这些诱导的角膜内皮样细胞从形态到功能都与人角膜内皮细胞有不同程度的差距。因此,我们把焦点重新回归到促进人角膜内皮细胞的增殖等能力上。眼眶脂肪干细胞(Orbital adipose-derived stem cell,OASCs)来源于神经外胚层的神经嵴细胞,与许多其他干细胞一样,具有强大的增殖能力和多谱系分化潜能。OASCs在保持干细胞特性的同时可以被数次传代培养,另外,角膜内皮细胞同样来源于神经嵴细胞。我们假设眼眶脂肪干细胞能够在保持角膜内皮细胞表型的同时促进其增殖和功能。并且,眼眶脂肪组织相对容易获得,可以提供足够数量的干细胞。本课题组分离并培养人眼眶脂肪干细胞(hOASCs),制备眼眶脂肪干细胞条件培养基,利用该条件培养基培养并扩增人角膜内皮细胞。体外实验结果表明,本研究培养的人角膜内皮细胞具有类似于体内的多边形状,显示较强的增殖能力,多次传代后依然表达角膜内皮细胞相关标志物。动物体内实验结果表明,人角膜内皮细胞能够在短期内使角膜内皮失代偿的动物角膜恢复透明及正常厚度,具有细胞替代治疗及干细胞治疗的潜力。研究目的1.培养并利用人的眼眶脂肪干细胞制备条件培养基;2.探讨应用眼眶脂肪干细胞条件培养基能否促进人角膜内皮细胞的增殖和修复能力;3.进一步检测培养的人角膜内皮细胞体内的细胞治疗能力,利用动物实验评估其用于治疗角膜内皮失代偿的效果。研究方法第一部分制备人眼眶脂肪干细胞源性条件培养基1.提取、培养人眼眶脂肪干细胞:用PBS反复冲洗眼眶脂肪组织,剪碎,37° C下将脂肪组织置于胶原酶消化,分散的组织重新悬浮于DMEM,室温下5分钟,再经70 μm滤网过滤。经洗涤、离心后,将细胞重悬,均匀接种在培养瓶内,置于37° C、5%C02条件下培养。应用流式细胞术以及免疫荧光染色检测细胞的相关标记物。2.制备条件培养基:培养人眼眶脂肪干细胞,吸除原培养基,无菌PBS轻轻漂洗1-2次,将刚刚配制并过滤的脂肪干细胞培养基加入到细胞中继续培养,吸出并收集培养细胞的上层液体,0.22um滤器过滤,-80° C保存备用。第二部分条件培养基促进人角膜内皮细胞增殖和功能的体外实验研究l。分离、培养人角膜内皮细胞:M199冲洗角膜,剥离后弹力层(含HCECs),然后使用胶原酶消化、离心,重悬细胞,将细胞悬液接种于12孔板的1孔中(预先包被FNC)。用提前制备好的条件培养基培养细胞。基础培养基由opti-MEM-I,8%胎牛血清,5 ng/mL人表皮生长因子(hEGF),20μg/mL维生素C、200mg/L氯化钙、0.08%硫酸软骨素和青霉素-链霉素等组成。2.检测人角膜内皮细胞的增殖及细胞修复能力:聚合酶链式反应、蛋白质印迹、免疫荧光等检测培养的人角膜内皮细胞相关标志物。应用细胞增殖检测试剂盒、划痕实验等检测人角膜内皮细胞的增殖及修复能力。第三部分人角膜内皮细胞修复能力的体内检测1.建立动物(新西兰大白兔、恒河猴)角膜内皮失代偿模型:动物行全身麻醉,眼局部表面麻醉,仰卧于手术台,开睑器开眼睑,做角巩膜缘隧道切口,粘弹剂注入前房,用改良后的冲洗针头仔细将角膜内皮细胞自后弹力层面刮除,然后进行充分的前房冲洗,使角膜内皮细胞全部脱离前房。2.将培养的人角膜内皮细胞进行体内移植:提前用CFSE标记人角膜内皮细胞。将角膜内皮细胞从实验动物的角膜后弹力层刮除,制作角膜内皮失代偿模型,抽取适量房水,然后用胰岛素针将标记的人角膜内皮细胞注射入前房内,结膜下及球周注射激素类药物,在全身麻醉下保持术眼向下的体位5小时。3.术后观察:术后应用裂隙灯、前节OCT、共聚焦角膜显微镜等评估角膜、前房等情况,并对角膜行组织学等检查。其中,恒河猴实验组进行了长期(大于一年)的术后观察,并进行前房角镜、眼底照相及B超等检查房角、眼底及眼球等情况。研究结果第一部分制备人眼眶脂肪干细胞源性条件培养基本研究中培养的人眼眶脂肪干细胞为贴壁细胞,形状为梭形、成纤维细胞样。流式细胞术检测显示,OASCs高度表达CD29、CD105、CD49e、CD166,提示其内皮细胞和干细胞的起源。免疫荧光染色显示,人眼眶脂肪干细胞高度表达波形蛋白。培养的人眼眶脂肪干细胞在10代之前形态及表型相似。第二部分条件培养基促进人角膜内皮细胞增殖和功能的体外实验研究本研究体外培养的人角膜内皮细胞表达N-Cadherin、Na/K ATPase、Zo-1、Col8a2和SLC4A4等相关内皮细胞标志物,可传10代以上并保持较强的增殖能力,体外实验结果显示其具有较强的细胞修复能力。在条件培养基的影响下,人角膜内皮细胞被赋予了类似于干细胞样的特性。第三部分人角膜内皮细胞修复能力的体内检测1.新西兰大白兔动物细胞移植实验及组织学检查:细胞移植术后裂隙灯及前节OCT等检查显示,人角膜内皮细胞在7天左右成功使角膜恢复透明,中央角膜厚度也较对照组明显变薄,同时也可见前房内渗出等反应。共聚焦角膜显微镜和茜素红染色证实在后弹力层上覆盖着多边形细胞。组织学检查:荧光显微镜检查可见CFSE标记的HCECs;角膜组织HE染色显示,细胞呈单层排列并紧密贴附在后弹力层之上。2.恒河猴细胞移植实验及组织学检查:裂隙灯显微镜和前节OCT显示,在细胞注射后7天左右角膜恢复透明,中央角膜厚度也明显变薄,排斥反应如角膜后沉着物(KP)和前房渗出在细胞注射后第10至14天出现,但经过术后处理可基本恢复正常。至术后一个月,细胞移植实验组的角膜变得更透明、厚度更薄,类似于正常天然猴角膜。术后眼压(I0P)与正常对照之间无差异。共聚焦角膜显微镜和茜素红染色证实在后弹力层上覆盖着多边形细胞。术后2个月组织学检查:荧光显微镜检查可见CFSE阳性的HCECs。免疫荧光染色检查结果显示,后弹力层上的细胞表达Na/KATP酶和ZO-1。角膜组织HE染色显示,细胞呈单层紧密贴附在后弹力层之上。3.恒河猴长期观察(一年以上):细胞移植实验组的角膜始终保持透明,厚度正常,使用前房角镜、眼底照相及B超等进行检查,与正常眼比较均未见异常改变。结论1.体外培养的人眼眶脂肪干细胞增殖能强,表达神经嵴细胞、干细胞等相关标志物。2.人眼眶脂肪干细胞源性条件培养基能够有效的体外扩增人角膜内皮细胞,并使其维持较强的细胞修复能力。3.在动物实验中,通过体内移植的方式,培养的人角膜内皮细胞可以修复内皮细胞受损的角膜,使角膜重新恢复透明。本研究课题发现眼眶脂肪干细胞源性条件培养基不仅能提高人角膜内皮细胞的增殖能力,而且对维持其功能特性也有明显效果,可以为进一步探索人角膜内皮细胞生物学特性、细胞及干细胞治疗提供来源和基础。