第一部分DNMT1和DNMT3a在氯化锂-匹罗卡品癫痫大鼠脑组织中的表达及其可能的机制目的：DNA甲基化受DNA甲基化转移酶(DNMT)催化，它是最重要的一种表观遗传修饰方式。越来越多的研究表明，中枢神经系统DNA甲基化可调控神经元网络活性和突触可塑性。课题组在前期研究中发现DNMT1和DNMT3a在难治性颞叶癫痫（TLE）患者脑组织中表达上调，由于研究中所用的患者脑组织不能用来了解DNMT1和DNMT3a的表达规律和时空变化，要获得正常脑组织来进行对照也受到道德伦理的约束，而氯化锂-匹罗卡品癫痫大鼠模型可以很好的模拟人类癫痫，了解其形成机制，所以我们希望通过此模型来研究DNMT1和DNMT3a在点燃鼠脑部中的表达及其规律，观察给予DNMT转移酶抑制剂（5-AZA）干预后点燃鼠行为学和脑电图的改变，探讨DNMT在癫痫起始阶段的作用机制。方法:实验分成二个部份。表达研究组选择健康雄性SD大鼠72只按1：8随机分成正常对照组和点燃组，点燃组采用氯化锂-匹罗卡品腹腔注射进行点燃，对照组则与等量生理盐水予以对照。动物点燃后再根据实验需要，按癫痫发作后不同时间点随机分成6小时、1天、3天、7天、14天、30天、60天7个亚组，每组8只（8只点燃失败或死亡予以剔除），在不同时间点处死动物，取点燃鼠和对照鼠海马，用免疫组化、免疫荧光双标和免疫印记方法检测DNMT1和DNMT3a蛋白的空间定位及表达规律。功能研究组选择同样大鼠24只，随机分为匹罗卡品组，DMSO+匹罗卡品组和5-AZA+DMSO+匹罗卡品组，每组8只。后两组在侧脑室注射DMSO或5-AZA+DMSO后与匹罗卡品组一起用匹罗卡品点燃，记录点燃鼠出现痫性发作的潜伏期、所需的匹罗卡品剂量和发作持续时间及脑电变化。结果：对照组大鼠脑组织中，DNMT1和DNMT3a主要在齿状回、CA1和CA3区的神经元胞核中表达，在点燃组中则不仅在神经元胞核，而且出现部分胞浆表达。点燃鼠脑组织中DNMT1和DNMT3a免疫阳性细胞均较对照组多且染色较深，DNMT1在点燃后6小时表达水平没有明显增加，点燃后1天增加，持续到第14天，在慢性期维持在相对较高水平。DNMT3a在点燃后6小时开始增高，1天和3天时表达最强，在潜伏期和慢性期稍有下降但仍处于较高水平。在干预实验中，匹罗卡品组和DMSO+匹罗卡品组大鼠均被成功点燃，5-AZA+DMSO+匹罗卡品组有5只出现癫痫发作，与匹罗卡品组和DMSO+匹罗卡品组相比，5-AZA+DMSO+匹罗卡品组有较高的癫痫阈值，诱发出现癫痫的潜伏期延迟，发作持续时间较短，5-AZA组癫痫鼠脑电图痫样活动较匹罗卡品组和DMSO+匹罗卡品组差。结论：点燃鼠DNMT1和DNMT3a在海马区表达增加和表达部位改变与难治性癫痫患者脑组织中的表达相同。5-AZA可使大鼠对致痫剂的敏感性下降，可能通过抑制DNMTs的功能而在癫痫起始环节抑制痫性发作，支持DNMTs表达上调参与了癫痫形成。第二部分RasGRF1在耐药性癫痫患者及点燃动物中的表达目的：Ras蛋白特异性鸟嘌呤核苷酸释放因子（RasGRF1）是一种Ras蛋白激活因子，主要在神经元中表达并大量聚集于突触。编码RasGRF1蛋白的基因是一个印记基因，其表达受表观遗传DNA甲基化调控，出生后RasGRF1表达增加与神经网络形成同步，在成熟脑中表达停止。很多证据表明RasGRF1可通过不同的信号传导通路对突触可塑性、神经元兴奋性和神经元轴突生长进行调控。课题组前期在耐药性癫痫患者脑脊液(CSF)蛋白组学研究中发现，RasGRF1在癫痫患者脑脊液中的表达较对照组低，为进一步了解其与癫痫的关系，我们扩大样本检测了难治性癫痫患者脑脊液中RasGRF1的表达，同时检测了RasGRF1在难治性癫痫患者和匹罗卡品点燃大鼠脑组织中的表达，探讨了RasGRF1在癫痫中的可能机制。方法：1癫痫患者脑脊液中RasGRF1的检测：从我院癫痫专病门诊中选择40例耐药性癫痫患者，定时腰穿获取脑脊液后用酶联免疫法测定RasGRF1的表达，并与30例无神经系统器质性疾病的对照者进行比较。2癫痫患者和点燃鼠脑组织中RasGRF1的表达：从课题组耐药性癫痫脑库中随机抽取30例患者手术切除的前颞叶新皮质作为癫痫患者实验组，9例头外伤后的颞叶新皮质作为对照组，分别用免疫荧光双标、免疫组化和免疫印记方法检测RasGRF1蛋白的表达。同时建立氯化锂-匹罗卡品颞叶癫痫大鼠模型，将64只SD大鼠按1:7的比例随机分为对照组和点燃组，点燃组给予氯化锂-匹罗卡品腹腔注射进行点燃，对照组注射生理盐水，动物点燃后再按实验需要，根据癫痫发作后不同时间点，随机分为1天、7天、14天、30天、60天5个亚组，每组8只（点燃失败或死亡大鼠予以剔除），在不同时间点分别处死动物，取点燃鼠的海马及颞叶皮层，用与癫痫患者脑组织同样的方法检测RasGRF1蛋白在点燃鼠不同时期（急性期，潜伏期，和慢性期）的定位和表达，并与对照组进行比较。结果：耐药性癫痫患者和对照组脑脊液中RasGRF1的浓度分别为0.965±0.057mg/L和1.408±0.092mg/L,差异有统计学意义（P<0.05）。免疫染色显示RasGRF1主要在患者及点燃鼠脑组织神经元胞膜和轴突表达，与MAP2阳性细胞共定位，而不与GFAP阳性的胶质细胞共表达。大鼠脑组织中，RasGRF1阳性细胞主要位于齿状回、CA1-CA3区和颞叶皮层。在耐药性癫痫患者和点燃鼠中，RasGRF1免疫染色均比对照组弱，而且所着色的神经元轴突变短。免疫印记显示，耐药性癫痫患者脑组织中RasGRF1蛋白的表达量较对照组低;癫痫鼠中RasGRF1蛋白的表达在点燃后1天开始下调，潜伏期持续进行性降低，慢性期时达到最低水平。结论： RasGRF1在耐药性癫痫患者和点燃鼠脑组织中表达下调，且RasGRF1染色的神经元轴突变短，表明RasGRF1作为一种突触蛋白，可能通过影响细胞骨架或信号通路参与了难治性癫痫的发生与发展；耐药性癫痫患者脑脊液中RasGRF1表达降低，与我们前期研究结果一致，其变化规律与癫痫患者和点燃鼠脑组织RasGRF1的表达相似，表明脑脊液中RasGRF1表达可以作为耐药性癫痫脑组织表达的一个生物标记物。