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目的:初步探讨人完全脱细胞羊膜(human acellular amniotic membrane,HAAM)的在犬椎体的诱导成骨的能力,为羊膜作为骨组织工程自然衍发基质提供实验依据,进而为骨缺损及椎体融合术提供新的治疗思路。方法:使用本课题组研发的羊膜无酸碱脱细胞专利技术制取HAAM,约2.0cm×2.0cm大小,做成约为0.3cm×0.3cm×1.2cm大小卷团状。15只成年家犬,将每只犬L1-L4椎体随机分为羊膜组、CPC组(calcium phosphate cement,CPC)、HAAM-CPC组和空白对照组。空白对照组经犬背侧椎弓根处单纯制作直径约0.3cm×0.3cm×1.2cm的椎体缺损;HAAM组在椎体缺损处植入HAAM;CPC组则植入CPC(约0.3cm×0.3cm×1.2cm大小);HAAM-CPC组在缺损处植入HAAM与CPC混合物(体积比1:1),以填满缺损处。分别在第2、4、6、8、12周时处死动物,每次3只,截取标记的骨缺损部位。即刻行CT检查,观察缺损处密度变化;甲醛固定后脱钙,切取手术部位横断面进行大体观察;常规石蜡定向包埋,切片,分别对其行HE染色,光学显微镜组织学观察和免疫组织化学染色(VEGF与Ⅳ型胶原),对比观察各组骨缺损处的成骨能力以及鉴别胶原组织来源。结果:CT观察:术后2周至12周,空白组骨缺损处密度逐渐增高,缺损处于12周时仅见手术遗迹,基本愈合;HAAM组于术后2、4、6周三个时间点,缺损处密度HAAM组略高于空白对照组,第8周,HAAM组缺损处密度与空白组相近,第12周HAAM组缺损处大部分已钙化,但密度较空白组低。CPC组和HAAM-CPC组于术后各时间点,缺损处影像学密度无明显变化,缺损区未变小,材料与宿主之间界限分明;大体标本观察:见HAAM组羊膜位于缺损区域,位置良好,随时间推移,羊膜与宿主之间逐渐形成致密结构,手术至缺损区逐渐缩小,羊膜逐渐被新生致密结构取代,但12周时,仍有部分羊膜未被吸收;空白组见缺损区被血凝快填充,随着时间推移,逐渐新生骨小梁结构,至12周,缺损区基本愈合,仅见手术遗迹;CPC组与HAAM-CPC组均可见植入材料填充缺损区域,但随时间推移,材料吸收不明显,与周围组织界限清晰。组织学观察:术后2周时,HAAM组中手术区域可见大量复层胶原纤维样结构填充其中,伸展良好,排列规整且致密,与宿主交界处可见促细胞生长,胶原层之间穿插大量新生血管,血管周边可见小淋巴细胞,交界处还可见残损纤细的骨小梁生长,彼此未连接呈网状,纤维胶原可见散在钙化;空白组手术缺损区中央可见大量出血,尚无肉芽组织及血管生成;周边形成肉芽组织,其内毛细血管生长较旺盛,血管周围可见嗜中性细胞,交界区可见不规则残损骨小梁生长。CPC组手术区域内部见大量泡沫样异物,异物与正常骨小梁交界处边界清晰,未见嗜中性细胞,未见新生血管结构;HAAM-CPC组见手术区域充满卷曲粗糙条索状均与粉末异物,与宿主交界处未见明显促细胞生长,交界区偶见毛细血管样结构,缺损区中央未见血管生成,局部出血,骨小梁少量生长。术后4周时,羊膜组中HAAM被进一步吸收,血管生成进一步增多,新生骨小梁趋于成熟。空白组骨缺损处小梁较前增粗,有连接成网的趋势,毛细血管丰富。CPC组与HAAM-CPC组镜下观察较前未见明显变化;术后6周时,HAAM组中羊膜进一步被吸收,血管生成旺盛,与宿主交界处可见肥大的软骨细胞,在羊膜与髓腔交界处向植入物内部延伸;空白组血肿被大量吸收,缺损边缘处亦可见大量血管生成,但较HAAM组略少,骨缺损处逐渐填充以软骨组织,并见少量破碎骨小梁;CPC组较前无明显变化;HAAM-CPC组材料与宿主交界处可见少量肥大的吞噬细胞。术后8周时,HAAM组中血管仍生成旺盛,羊膜与宿主界限可见新生骨板,羊膜钙化明显;空白组血肿被吸收,手术部位可见部分新生骨小梁,与未手术部位界限不清,缺损边缘处亦可见大量血管生成;CPC组材料与宿主间可见吞噬细胞,界限尚清,余较前无明显变化;HAAM-CPC组材料与宿主交界处可见吞噬细胞,余无明显变化。术后12周时HAAM组中羊膜进一步被吸收,血管生成旺盛,与宿主交界处可见大量新生骨板,羊膜钙化明显;空白组缺损处几乎愈合,可见大量新生骨小梁交织成网状;CPC组材料与宿主间可见大量肥大吞噬细胞,部分材料与宿主之间可见互相穿插融合;HAAM-CPC组材料与宿主交界处可见肥大的吞噬细胞,但材料与宿主之间界限较轻,融合不明显。VEGF染色观察:术后2周至12周,HAAM组在羊膜表面持续阳性表达;空白组术后2周至8周持续阳性表达,12周时几乎不表达,术后2、4、6周,HAAM组表达强于空白对照组,且结合形态学特点,可见HAAM募集大量干细胞,术后8周,两组表达情况相近;CPC组术后8周出现弱阳性表达,术后12周较8周表达增强,但仍明显较HAAM组差;HAAM-CPC组于术后2周即出现弱阳性表达,此后表达状况一直持续,至术后12周表达有较明显增强,于CPC组接近。Ⅳ型胶原染色:术后6周可见HAAM阳性表达。结论:HAAM在犬椎体具有更快的促血管生成及骨诱导能力,可以作为骨组织工程自然衍发基质候选物材料,为骨缺损和骨融合的治疗提供新的治疗思路,也为其成为基因及药物的良好载体提供试验依据。