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共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid,CLA)是一组具有共轭双键(—C=C—C=C—)的十八碳二烯酸位置与几何异构体混合物的总称。一般认为CLA因其双键的位置及构型共有16种同分异构体,但在这十几种同分异构体中,只有c9,t11-CLA和t10,c12-CLA两种具有生理活性,且与人体及动物营养密切相关。CLA作为一种新型的营养保健品,除了具有很强的抗癌功能外,还具有抑制脂肪沉积、降低胆固醇、防止动脉硬化、改善人体代谢、调节血糖、防治糖尿病、增强免疫力、提高骨骼密度、抗氧化、改善睡眠等作用。CLA的天然来源十分有限,生物法合成CLA是利用微生物亚油酸异构酶(Linoleic acid isomerase,LAI)的作用,转化亚油酸(Linoleic acid,LA)或其衍生物生成CLA的技术,其底物多采用亚油酸、蓖麻油、葵花籽油、玉米胚芽油等一些昂贵的材料,合成成本较高。我国是油菜种植大国,每年菜油的产量多达1000万吨,菜油脚料是提取菜油过程中菜籽油水化脱磷脂的废弃物。按油脚量为菜油的1.5%左右估算,我国每年约有15万吨的菜油脚料产生。菜油脚料残存油脂中含有的亚油酸完全可以在亚油酸异构酶的作用下转化生成极具生理活性的功能性脂肪酸—共轭亚油酸。该技术的应用,将首先解决化学法高温、高压条件下毒副产物的形成问题,提高CLA的产品质量;其次解决传统生物合成法转化率低、生产周期长,成本高、污染大等诸多问题,实现高效率、高品质、低消耗、无污染生产,满足市场对CLA日益增长的需求,同时为农业废弃物—菜油脚料的研究开发提供有力的依据。本文首先对嗜酸乳杆菌CGMCC1.1854、植物乳杆菌CGMCC1.557和本实验室从泡菜中筛选得到的植物乳杆菌3-9的产酶条件进行了摸索,通过在其MRS培养基中添加不同浓度的LA诱导物诱导其产生亚油酸异构酶,发现这三株菌体对这种诱导物的敏感程度有所不同。当添加的LA浓度为0.1mg/m L时,植物乳杆菌CGMCC1.557和植物乳杆菌3-9诱导产生的亚油酸异构酶活性最强;当添加的LA浓度为0.3mg/mL时,嗜酸乳杆菌CGMCC1.1854诱导产生的亚油酸异构酶活性最强,由此确定了每种菌产酶培养时诱导物的最佳添加量。随后利用硫酸铵分级沉淀确定了嗜酸乳杆菌CGMCC1.1854、植物乳杆菌cgmcc1.557和植物乳杆菌3-9亚油酸异构酶的最佳硫酸铵饱和度范围,其中嗜酸乳杆菌cgmcc1.1854lai的硫酸铵饱和度下限为30%,上限为80%,植物乳杆菌cgmcc1.557和植物乳杆菌3-9lai的硫酸铵饱和度下限为40%,上限为80%。然后通过透析除盐、聚乙二醇浓缩、凝胶过滤层析得到了电泳纯的亚油酸异构酶,实现了对这三种菌亚油酸异构酶的分离纯化。接着比较了这三种乳酸菌亚油酸异构酶的最适反应温度、最适反应ph、酶的热稳定性、酸碱稳定性、以及动力学参数。其中嗜酸乳杆菌cgmcc1.1854亚油酸异构酶的最适温度为30℃,植物乳杆菌cgmcc1.557和植物乳杆菌3-9亚油酸异构酶的最适温度均为45℃;三者亚油酸异构酶的最适反应ph均为6.5;嗜酸乳杆菌cgmcc1.1854亚油酸异构酶受温度影响较为显著,此酶不耐热,而植物乳杆菌cgmcc1.557和植物乳杆菌3-9在低温下酶活保持相对稳定,在高温下前者稳定性不如后者;嗜酸乳杆菌cgmcc1.1854亚油酸异构酶受ph的影响较为显著,其酸碱稳定性最差,植物乳杆菌cgmcc1.557亚油酸异构酶在ph3.0~6.0之间基本保持稳定,ph高于6.0时,稳定性变差,植物乳杆菌3-9的亚油酸异构酶能适应较宽的ph范围,其酸碱稳定性最优;同时还确定了这三株乳酸菌亚油酸异构酶的动力学参数,嗜酸乳杆菌cgmcc1.1854亚油酸异构酶的km值为18.99mmol·l-1,vmax为1.58ug·ml-1·min-1;植物乳杆菌1.557亚油酸异构酶的km值为14.83mmol·l-1,vmax为1.75ug·ml-1·min-1;植物乳杆菌3-9亚油酸异构酶的km值为14.26mmol·l-1,vmax为1.94ug·ml-1·min-1。通过比较嗜酸乳杆菌cgmcc1.1854、植物乳杆菌cgmcc1.557和植物乳杆菌3-9的亚油酸异构酶在各自最适ph和最适反应温度下转化亚油酸生成共轭亚油酸能力的大小,确定了植物乳杆菌3-9的亚油酸异构酶转化能力最强,转化生成的共轭亚油酸是植物乳杆菌cgmcc1.557的1.17倍,是嗜酸乳杆菌cgmcc1.1854的1.72倍。然后比较了嗜酸乳杆菌cgmcc1.1854、植物乳杆菌cgmcc1.557和植物乳杆菌3-9的亚油酸异构酶在各自最适ph和最适反应温度下转化菜油脚料生成共轭亚油酸能力的大小,确定了植物乳杆菌3-9的亚油酸异构酶转化能力最强,转化生成的共轭亚油酸是植物乳杆菌cgmcc1.557的1.03倍,是嗜酸乳杆菌cgmcc1.1854的1.19倍。综合以上结论,选择植物乳杆菌3-9的亚油酸异构酶为转化菜油脚料生成共轭亚油酸的酶类。通过一系列单因素实验,优化了植物乳杆菌3-9酶促菜油脚料生成共轭亚油酸的最佳底物添加量、缓冲液种类、振荡速度、转化时间,然后设计四因素三水平的正交实验,确定了最佳反应条件:底物添加量为3.0m L、缓冲液为磷酸钾缓冲液、振荡速度为100r/min、转化时间为18h,此时酶促菜油脚料生成共轭亚油酸的产量为244.85±4.91ug/m L,是优化前的1.31倍。最后通过研究辅酶因子、金属离子、螯合剂对酶促反应的影响,确定了辅酶因子ATP、ADP、NADH以及金属离子Ca2+、Mg2+对酶的催化活性有一定的促进作用。然后设计了金属离子和辅酶因子的组合实验,探讨了两者的结合对酶促反应的影响,结果表明Ca2+和ATP的结合能很好地促进反应的进行,实现了植物乳杆菌3-9亚油酸异构酶酶促转化菜油脚料生成共轭亚油酸激活剂的筛选,添加了这二者激活剂后的CLA生成量是未添加的1.27倍。