生物节律是生物的基本生命现象之一,钟基因的节律近乎完美的表现为功能和行为节律。在基因与基因之间、不同细胞之间、不同组织之间、器官和系统之间,钟基因都起着重要的调控作用,应为生物钟的调控作用才使得生物体能很好地适应环境。既然生物钟对生物体的调控作用如此的广泛和重要,那么在研究各种生命现象时我们必须的考虑到生物钟的作用,因而深入研究生物钟基因和钟控基冈的调控网络,研究乳腺组织的生物钟基因的局部调控作用和机制,探索生物钟基因的功能十分重要。本研究对小鼠泌乳期和退化期乳腺组织中差异表达的基因以及昼夜间差异表达的基因进行筛选,并对筛选出的基因进行节律变化的研究,目的在于筛选出乳腺组织中与泌乳相关的钟控基因,并对筛选出的基因结构、功能及表达调控进行分析。解析其昼夜变化规律,以便进一步阐明乳腺发育以及泌乳的昼夜节律变化分子调控机制,为乳腺发育及乳腺发育调控提供理论依据。本实验采用Affymetrix公司的Mouse Genome4302.0Array全基因组表达谱芯片,对昆明鼠不同发育时期以及昼夜之间差异表达的基因进行筛选,并通过泌乳期同退化期乳腺组织中基因表达情况的对比,获得泌乳相关钟控基因,应用荧光定量RT-PCR技术对芯片结果进行验证。基因芯片获得的结果首先经过数据标准化,标准化后的数据进行各组间的对比。昼夜之间共筛选出965个差异表达基因,其中在白天相对于夜晚高表达基因629个,低表达基因336个。泌乳期同退化期之间共筛选出5317个差异表达基因,其中在泌乳期相对于退化期高表达基因2137个,低表达基因3180个。将筛选出的差异表达基因进行Gene ontology分析显示：在泌乳期乳腺中高表达的基因功能主要集中在乳汁的合成和分泌上。昼夜差异表达的基因功能主要集中在生物节律上。将筛选出的差异表达基因进行Pathway分析,得到相对活跃的信号通路。根据芯片结果,选取Per1、Per2、Bmall、Cryl、Cry2基因,对其在乳腺组织不同发育阶段,以及泌乳期与青春期乳腺组织不同时点的表达情况,应用荧光定量PCR法进行研究。结果表明,Per2和Bmall对乳腺的发育有较大的影响,Per2在青春期以及孕中期的乳腺组织表达量升高(P<0.05)。Bmall在青春期以及孕中期的乳腺组织持续低表达,而在泌乳期以及退化期持续高表达(P<0.05)。而Perl、Cryl和Cry2对乳腺发育则基本没有影响(P>0.05)。在不同光照条件下对Clock基因在视上核(SCN)和乳腺组织内表达节律进行分析,结果表明,在12h光照/12h黑暗(LD)条件下,乳腺组织同SCN内Clock基因的表达相位基本呈现反向关系,而在全黑(DD)条件下,乳腺组织同SCN内Clock基因的表达相位基本同步。采用RNA干扰技术分别对Clock和Per1基因进行功能分析,采用高效液相色谱技术检测Clock和Per1基因表达量发生变化后,乳腺上皮细胞内酪蛋白、乳糖的变化,同时应用紫外吸收法检测甘油三脂的变化。结果表明,Clock基因有显著抑制乳蛋白、乳糖和甘油三脂合成的作用(P<0.05)。Per1基因对乳腺上皮细胞酪蛋白、乳糖和甘油三脂合成具有显著抑制作用(P<0.05)。