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背景与目的：缺血性脑血管病是人类健康的重要危害,急性脑梗死后血脑屏障(blood brain barrier, BBB)开放使得病程早期即造成脑水肿,而随着病程进展,血脑屏障的持续开放将使得脑水肿加重,并增加出血转化的风险,因此,卒中早期的治疗重点是减轻血脑屏障的渗出。然而,脑卒中的治疗方法仍然相当有限,急性期的动静脉溶栓治疗是唯一认可的有效措施,但其严格的时间窗限制约束了很多卒中患者在急性期得到有效的治疗,因此遗留不同程度的残疾。相对于急性期的治疗,促进轴突再生是恢复期患者的治疗重点。“神经血管单元”(neurovascular unit, NVU)理念使得卒中研究者不仅仅关注于血管内皮细胞、神经元等热点研究对象,同时重视了细胞外基质(extracellular matrix, ECM)等周围组织。细胞外基质在结构上支撑内皮细胞、外周细胞及胶质细胞等,功能上还参与一些信号传导通路,在神经血管单元中起到纽带连接的作用。Fibulin-5是细胞外基质中的重要成员,通过与整合素受体的结合增强内皮细胞与ECM的粘附,同时,垂直方向的粘附增强促进水平位内皮细胞间紧密连接蛋白(tight junction, TJ)的表达,从两个方面维护BBB的完整性。此外,Fibulin-5通过竞争纤维连接蛋白与内皮细胞表面的整合素受体α5β1的结合而达到抑制整合素信号通路传导的作用,从而减少活性氧(reactive oxygen species, ROS)产生。脑缺血后大量产生的ROS可以直接引起内皮细胞凋亡,激活基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs),减少TJ表达,促进BBB的渗出,因此过表达的Fibulin-5存在保护BBB的作用。ROS还具有第二信使分子的作用,过表达Fibulin-5对ROS产生的调节还可以启动GSK-3β/CRMP-2通路,对其进行磷酸化修饰从而改变其活性状态。然而GSK-3β/CRMP-2通路与轴突再生密切相关,促进神经元微管的装配以及轴突的延伸,因此,Fibulin-5是一种多功能分子,下调脑缺血再灌注后的ROS,不仅保护血脑屏障的完整性,同时还可能参与轴突再生的信号通路。整合素信号通路诱导的ROS产生得助于活性的Rac-1参与,故Fibulin-5参与的调控ROS机制需要进一步深入探索。同时,Fibulin-5还能与胞外超氧化物歧化酶(extracellular superoxide dismutase, eSOD)结合,介导细胞外ROS的降解。综合来看,Fibulin-5从ROS的来源和清除两方面调控其产生,具有明确的抗氧化应激作用,因此本实验采用转染Ad-FBLN的MCAO/再灌注大鼠实验模型,研究过表达Fibulin-5干预对MCAO/再灌注后BBB和轴突再生的影响及其机制。方法：第一部分：1.建立过表达Fibulin-5重组腺病毒(Ad-FBLN)转染动物模型,颅内立体定位注射不同滴度腺病毒后,采用激光共聚焦观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的分布和强度以明确是否转染成功,荧光定量PCR和Western-blot检测腺病毒转染后Fibulin-5 mRNA和蛋白表达水平,同时结合各个滴度及对照病毒和生理盐水(normal saline, NS)注射后引起的周围脑组织炎症反应的强弱确定最佳腺病毒载体滴度。2.随机将模型鼠分组：假手术组(sham), MCAO/再灌注组(I/R),过表达Fibulin-5腺病毒干预MCAO/再灌注组(Ad-FBLN+I/R),空载体腺病毒干预MCAO/再灌注组(Ad-HK+I/R)。病毒转染后7天行大脑中动脉闭塞(MCAO)/再灌注手术,于1d和3d时间点行神经功能评分。3.脑缺血再灌注后1d,采用Tunel染色,免疫荧光双标和Western blot法测定脑细胞和血管内皮细胞的凋亡情况,包括：双标血管内皮细胞标记物CD31和caspase-3,检测凋亡相关蛋白(caspase-3和p-Akt)的表达等。4.MRI检测脑缺血再灌注后1d,3d脑水肿的情况,伊文思蓝漏出率检测血脑屏障的通透性以及电镜观察病变后各模型组血脑屏障的超微结构。5.免疫荧光双标检测脑缺血再灌注后1d和3d紧密连接蛋白occludin的形态学表达变化,occludin和MMP-9的蛋白水平变化采用Western blot方法检测。6. ELISA检测各模型组脑缺血再灌注后1d和3dROS的含量,SOD活性试剂盒检测T-SOD活力的变化。免疫荧光双标法检测SOD3和血管的表达关系。7.免疫组化检测各模型组NADPH的表达情况,荧光定量PCR检测各模型组NOX2的mRNA表达情况,Rac-1活性试剂盒检测活性Rac-1的水平。第二部分：1.造模及实验分组同第一部分。脑缺血再灌注后3d和7d,采用Western blot方法检测GAP-43、Fibulin-5、p-GSK-3β、GSK-3β、 p-CRMP-2、CRMP-2的蛋白表达水平。2.荧光定量PCR检测脑缺血再灌注后3d和7d,GAP-43、Fibulin-5的mRNA表达水平。3.MCAO/再灌注后3d和7d, GAP-43在病变侧皮质的表达和分布采用免疫荧光法测定。4.脑缺血再灌注后6周,BDA顺行性标记神经轴突,计算各模型组健侧纤维侧枝跨越中线至缺血侧红核的神经纤维数,以确定缺血后过表达Fibulin-5的干预对神经轴突再生的影响。5. ELISA检测各模型组脑缺血再灌注后3d和7dROS的含量,Rac-1活性试剂盒检测相同时间点活性Rac-1的水平。6.脑缺血再灌注后3d,7d和28d,采用神经功能评分,平衡木行走以及楼梯实验的方法对各模型组大鼠进行运动功能评价,明确过表达Fibulin-5的干预对缺血后大鼠神经功能的影响。结果：第一部分：1.根据各滴度重组腺病毒转染大鼠后,GFP的表达,Fibulin-5的mRNA,蛋白水平以及引起IL-1β的表达,确定9.5×1010pfu/ml为本实验的最佳转染病毒滴度。2. MCAO/再灌注后1d和3d,Ad-FBLN干预组与缺血再灌注组和Ad-HK干预组相比,神经功能评分明显改善(P<0.01,P<0.05)。3. MCAO/再灌注后1d和3d,过表达Fibulin-5减少了脑细胞,尤其是血管内皮细胞的凋亡,Western blot同样证明了凋亡相关蛋白caspase-3和p-AKT在Ad-FBLN组的表达与其他相比有显著性差异(P<0.05)。4.脑缺血再灌注后1d和3d,过表达Fibulin-5干预后BBB的渗出和脑水肿较I/R和Ad-HK干预组明显减少(P<0.05,P<0.01；P<0.05)；MMP-9的蛋白表达低于I/R和Ad-HK干预组(P<0.05); occludin蛋白的水平显著高于I/R和Ad-HK干预组(P<0.05)。5.脑缺血再灌注后1d和3d,Fibulin-5过表达组内脑组织ROS的表达降低(P<0.05,P<0.01),同时使得血管结合SOD3增多,但未影响T-SOD的活性(P>0.05)。6.过表达Fibulin-5后NADPH在Ad-FBLN干预组、UR组和Ad-HK干预组的表达均高于sham组(P<0.05),但这三组间无统计学差异(P>0.05), NOX2的mRNA水平检测中观察到了类似的结果,但过表达Fibulin-5影响了Rac-1的活性,即：GTPase Rac-1表达较其余模型组增高(P<0.05)。第二部分：1.脑缺血再灌注后3d和7d,Fibulin-5、GAP-43蛋白表达较假手术组增多(P<0.01),过表达Fibulin-5后,其表达明显增加(P<0.05)；p-GSK-3β的蛋白水平在缺血再灌注后升高,过表达Fibulin-5干预后明显增加其表达(P<0.01); p-CRMP-2蛋白水平在脑缺血再灌注后升高明显(P<0.01),而过表达Fibulin-5降低了其表达,有统计学差异(P<0.01), CRMP-2与p-CRMP-2蛋白的趋势相反。2.脑缺血再灌注后3d和7d,相比于sham组GAP-43 mRNA的水平明显增高(P<0.05),而过表达Fibulin-5干预后,GAP-43 mRNA仍明显高于I/R和Ad-HK干预组(P<0.01)；免疫荧光结果中同样观察到GAP-43的表达在Ad-FBLN干预组较I/R和Ad-HK组明显增多(P<0.05,P<0.01)。3.脑缺血再灌注后6周,过表达Fibulin-5干预组红核平面可以观察到缺血对侧密集的神经纤维侧枝跨过中线,纤维数明显多于I/R和Ad-HK干预组(P<0.05),而在I/R和Ad-HK干预组,跨过中线的神经纤维数未见统计学差异(P>0.05)。4.脑缺血再灌注后3d和7d,各模型组ROS的含量均高于sham组(P<0.01),且I/R和Ad-HK干预组之间无统计学差异(P>0.05),但过表达Fibulin-5降低了ROS的产生(P<0.01)。同样地,过表达Fibulin-5改变了Rac-1的活性,使GTP Rac-1表达水平较I/R和Ad-HK干预组明显降低(P<0.05)。5.脑缺血再灌注后3d,7d和28d,神经功能评分、平衡木行走和楼梯实验中,过表达Fibulin-5干预较I/R和Ad-HK干预组改善了大鼠运动功能恢复,有显著性差异(P<0.05,P<0.01)。结论：1.过表达Fibulin-5通过减少血管内皮细胞的凋亡,紧密连接蛋白的降解,MMP-9的激活而减轻MCAO/再灌注后BBB渗出和脑水肿,并且改善神经功能评分。2.过表达Fibulin-5保护BBB的机制可能是通过降低Rac-1活性蛋白的表达和增加SOD3和血管的结合,从而减少ROS的产生。3.过表达Fibulin-5增强缺血皮层周围GAP-43的表达和健侧皮层传出纤维侧枝芽生,促进轴突再生,改善神经功能。4.过表达Fibulin-5调控ROS的产生后启动GSK-3β/CRMP-2通路,使得p-GSK-3β表达升高和p-CRMP-2表达降低,从而达到促进轴突生长的作用。