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目的:本研究拟从大量药食两用的益生菌中选择适宜发酵黄芪的菌种,用来进行发酵黄芪的实验,筛选出发酵黄芪的最佳发酵菌种和最优工艺,通过发酵实验,最终使发酵体系的有效成分提取率有所提高。并且确定最佳发酵工艺后,对黄芪发酵液进行评价,以期对黄芪发酵体系的物质基础有一定的理解和阐释。方法:1.本研究按照2015版药典黄芪含量测定方法对不同批次的黄芪药材进行含量测定,选择毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷的含量最高的黄芪药材。2.建立黄芪总皂苷、总黄酮、粗多糖的紫外分光光度计检测法;建立毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素的HPLC-DAD测定方法;建立黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪甲苷的HPLC-ELSD测定方法;3.本研究通过以黄芪总皂苷、总黄酮、粗多糖、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪甲苷的综合评分为指标,从保加利亚乳杆菌、肠膜明串珠菌、凝结芽包杆菌、植物乳杆菌,发酵乳杆菌、嗜热链球菌、枯草芽孢杆菌、蝉拟青霉、青霉、红曲霉、黑曲霉、蛹虫草、槐耳等菌种筛选出黄芪发酵菌株;4.采用正交实验法优化黄芪发酵的酶解工艺,优化因素为加酶种类、酶解时间、加酶量、酶解温度;然后在此基础上采用响应曲面实验法优化了黄芪发酵工艺,优化因素为:发酵时间,起始pH,黄芪添加量;5.分别采用硫酸-蒽酮法测定粗多糖,芦丁比色法测定总黄酮,硫酸冰乙酸法测定总皂苷;以及毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素四种黄酮类成分的HPLC-DAD方法和黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ三种皂苷类成分的HPLC-ELSD方法;还有UHPLC-QTOF-MS方法并且用上述方法对黄芪发酵品进行了质量研究。结果:1.按照药典方法评价了从不同公司和产地采购的黄芪药材的毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷含量。结果表明购买的黄芪药材毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷的含量均符合药典要求,其中,浑源万生的毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷含量最高,分别为0.0652%和0.1158%,因此选择浑源万生的黄芪药材作为实验药材。2.建立黄芪发酵制品的评价方法,分别是粗多糖采用硫酸-蒽酮法,总黄酮采用芦丁比色法,总皂苷采用硫酸-冰乙酸法,这三种方法的标准曲线分别为y=0.0103x+0.0115、y=0.0163x+0.013、y=0.017x-0.0348,相关系数均大于0.999,线性良好。精密度、稳定性、重现性一级加样回收符合要求;实验建立的HPLC-DAD含量测定方法可以同时测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素四种黄酮类成分,HPLC-ELSD含量测定方法可以同时测定黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ三种皂苷类成分,他们的回归方程分别为y=6205.4x-11.21、y=13095x-78.307、y=15598x-151.23、y=17506x+47.458、y=148493x+4297.5、y=162934x+7795.6、y=47307x+2131.8且相关系数r均大于0.999,精密度、稳定性、重现性实验的RSD值均小于3%;加样回收率分别为100.54%、100.25%、100.86%、99.37%、100.13%、100.15%、100.17%,RSD分别为1.37%、0.56%、1.20%、1.62%、0.06%、0.34%、0.06%;同时还建立了基于UHPLC-QTOF-MS的黄芪成分检测方法。3.从保加利亚乳杆菌、肠膜明串珠菌亚种、凝结芽包杆菌、植物乳杆菌,发酵乳杆菌、嗜热链球菌、枯草芽孢杆菌、蝉拟青霉、青霉、红曲霉、黑曲霉、蛹虫草、槐耳等菌种筛选出黄芪发酵菌株,最终确定黄芪发酵菌株为枯草芽孢杆菌亚种纳豆芽孢杆菌。4.采用正交试验对黄芪的酶解工艺进行了优化实验,首先根据加酶种类、加酶量。酶解时间和酶解温度等单因素中选出最佳的加酶种类为纤维素酶和果胶酶的混合酶系,然后以加酶量。酶解时间和酶解温度为试验因素,设计三因素三水平的正交试验,最终的酶解工艺为加酶量0.1%,酶解时间为60min,酶解温度为50℃;采用响应曲面实验法对黄芪的发酵工艺进行了优化实验,首先进行了单因素试验,分别是黄芪添加量、起始pH、发酵时间、接菌量、碳源添加量、氮源添加量,根据单因素实验结果去除对黄芪发酵结果影响不明显的因素,最终以黄芪添加量、起始pH、发酵时间为实验因素,设计三水平的响应曲面优化黄芪发酵工艺,最终的最佳发酵工艺为黄芪添加量为13%,发酵时间为7d,接菌量为3mL,起始pH为6.50。5.采用建立的方法对黄芪发酵品进行了评价研究,结果表明黄芪发酵品的多糖含量较发酵前降低,总皂苷增加了约为9.21%,总黄酮含量增长约36.43%。毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮含量降低,芒柄花苷、芒柄花素含量升高,黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅱ含量升高,黄芪皂苷Ⅰ含量降低。通过全成分分析,表明黄芪发酵品中苷类物质减少,苷元类增加。结论:采购的五批黄芪药材的毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷的含量均符合药典要求,以浑源万生的含量最高,质量最优,可以作为实验药材。实验表明优选出的枯草芽孢杆菌亚种纳豆芽孢杆菌对黄芪含量影响总体呈现良好趋势,可增加主要成分的含量。验证实验显示采用优选的酶解工艺效率高,耗能少,溶出度高。发酵工艺稳定、节约。高效,符合实验室要求。实验建立的HPLC含量测定方法均专属性强、重现性好本论文通过枯草芽孢杆菌发酵处理,使得成分的含量有所增加,为黄芪发酵的研究工作奠定了一定的基础。