失代偿性肝硬化(LC)是一种常见的终末期肝病。常规的内科治疗虽能改善临床症状,却不能逆转肝细胞数量日益减少导致的肝功能逐渐减退。原位肝移植是目前最有效的治疗失代偿性肝硬化的方法,但因供肝缺乏、免疫排斥、手术风险、费用昂贵等诸多因素,限制了临床的广泛应用,因而,急需寻找一种新的治疗技术。近年来,干细胞在再生领域所取得的巨大进展为肝病的治疗提供了新的视角。国内外大量研究表明,骨髓来源的干细胞具有跨胚层分化的潜能,如在适宜的体内外环境下,可向内胚层的肝细胞分化。1999年,Petersen等首次报道了大鼠骨髓干细胞可以分化为肝卵圆细胞,进而分化为肝细胞和胆管上皮细胞,这是干细胞用于肝病治疗的一个里程碑式实验,为近年来骨髓源性干细胞在肝硬化治疗领域所取得的成就,也提示着其具有向肝细胞分化的潜能,有望为急性肝衰竭、终末期肝病和遗传代谢性肝病的治疗带来新希望。我科经第四军医大学西京医院伦理委员会的批准,已完成了20例自体PBMCs移植治疗失代偿性肝硬化的临床试验,结果显示PBMCs移植能在一定程度上改善失代偿性肝硬化患者的肝功能。但是,导致这一良好临床疗效的机制还不清楚,本课题将通过体内外实验对其进行探讨。【目的】1、研究源自失代偿性肝硬化患者的PBMCs在体外能否向肝样细转化;2、探讨源自失代偿性肝硬化患者的PBMCs能否在裸鼠肝内定植、分化,并表达人肝细胞的标志物;3、建立失代偿性肝硬化的动物模型,研究PBMCs移植对肝硬化大鼠的治疗作用;4、比较单纯G-CSF动员治疗及G-CSF动员联合PBMCs移植治疗两种方案对肝硬化治疗效果,并探讨其可能的机制。【方法】1、利用重组人肝细胞生长因子及表皮生长因子-4对从肝硬化病人分离的PBMCs进行体外诱导,用倒置显微镜对诱导细胞进行形态观察;2、采用细胞免疫化学、PAS染色、RT-PCR、Western Blot检测诱导细胞肝细胞特异的分子表达;3、采用ELISA方法检测诱导细胞上清中肝细胞合成、分泌及排泄的物质;4、采用PKH26-GL红色荧光标记技术,将分离的PBMCs进行体外标记及体内示踪;5、通过PRINS技术,采用人的性别决定基因SRY、及鼠的性别基因SRY对移植细胞进行体内示踪;6、采用免疫组织化学、RT-PCR、Western Blot技术检测接受肝硬化病人的PBMCs移植的裸鼠肝内是否有人肝细胞标志物表达;7、采用0.6%CCl4橄榄油,按0.3ml/100g的剂量,每隔3天经腹膜内注射一次,连续16周,制造SD大鼠的肝硬化模型;8、采用大鼠全自动生化分析仪检测移植前肝硬化大鼠的肝功能及各种治疗后不同时间点大鼠肝功能;9、通过组织标本HE染色观察不同处理组肝硬化大鼠的病理学改变;10、数据用均数±标准差表示,采用SPSS13.0统计学软件,用t检验、秩和检验及单因素方差分析对资料进行统计分析。【结果】1体外成功将源自肝硬化病人的PBMCs诱导成肝样细胞采用密度梯度离心法分离了经G-CSF动员的肝硬化病人的PBMCs,体外利用HGF、FGF-4联合诱导7天后,观察到PBMCs呈多边形、卵圆形等类似肝样细胞的形态。细胞免疫化学、RT-PCR、Western Blot及ELISA的结果表明这些具有肝样细胞形态的细胞同时具有某些肝细胞的功能,如有CK18、ALB、CYP3A4等标志物的表达。这些结果提示源自肝硬化病人的PBMCs在体外经诱导能向肝样细胞转化。2 PBMCs能定植于裸鼠的肝脏,并表达人的肝细胞标志物先前Wang等研究表明,经外周静脉输入纯化的人造血干细胞给免疫缺陷小鼠,接着给予CCl4诱发受体鼠肝功能损伤,1月后在受体鼠肝内检测到表达人类ALB的肝细胞。本研究采用将肝硬化病人PBMCs移植入急性肝脏损伤的裸鼠体内,观察其定植、分化的情况。PKH26及SRY示踪的结果显示移植的PBMCs能定植于裸鼠的肝脏。而且,我们在裸鼠的肝组织内还检测到人肝细胞标志物ALB、CK18的表达。这些结果提示,源自肝硬化病人的PBMCs能迁移、定植于裸鼠的肝脏,并在肝内微环境下向肝细胞转化。3成功建立了肝硬化动物模型,并从中观察到动员的PBMCs的治疗作用CCl4造成大鼠慢性肝损伤12w时,其肝功指标与正常对照组具有显著性差异(P<0.01),肝脏病理组织学提示大鼠肝硬化形成,在此基础上继续造模4 w,制造失代偿性肝硬化动物模型。将雌性肝硬化大鼠分4组(T1、C1、T2、C2)。T1组接受经动员的雄性肝硬化大鼠的PBMCs移植,C1组为其对照组;T2组经G-CSF动员后行PBMCs移植,C2组单纯接受G-CSF动员治疗并作为T2组的对照组。PBMCs移植术后2w、2m,T1组与C1组相比,血清ALT、AST、TBIL均下降(P<0.05),而血清ALB升高(P<0.05);T2组与C2组相比,血清ALT、AST、TBIL均下降,两组间有显著性差异(P<0.05),而两组血清ALB水平则均升高,无显著性差异(P>0.05)。在移植术后的第2w和第2m,实验组大鼠肝内均发现有散在PKH26标记的红色荧光的细胞,而对照组大鼠在相应时间点未见有PKH26标记的细胞。在上述时间点,在接受雄性肝硬化大鼠PBMCs移植的雌性肝硬化大鼠肝内还检测到SRY的表达,而对照组大鼠肝内则未检测到SRY的表达。这些结果提示移植的PBMCs能定植于肝硬化大鼠的肝脏。移植术后6m处死各治疗组大鼠,取其肝组织行病理组织学检查,结果显示:T1与C1组,T2组与C2组,大鼠肝细胞坏死、脂肪变性、炎症细胞浸润程度均减轻,两组半定量分级评分显示差异不具有显著性(P>0.05),而肝纤维化病变改变程度,两组半定量分级评分显示差异具有显著性(P<0.05)。这一结果提示造模停止6月后,CCl4诱导的肝硬化模型大鼠的肝细胞坏死,脂肪变性等病变可能通过自体肝细胞的增殖而修复,但纤维化改变不可逆,经PBMCs移植,或单纯G-CSF动员治疗后,纤维化程度明显减轻。【结论】本研究揭示了肝硬化患者的PBMCs在体外能分化成肝样细胞,在体内可以定植于损伤的肝脏,并在其微环境下向肝细胞转化。在肝硬化动物模型上的研究结果再次表明,骨髓源性的PBMCs能定植于硬化的肝脏并参与其损伤的修复。另外,我们的研究还发现单纯G-CSF动员也能在一定程度的修复受损的肝脏,并改善其功能。