研究背景:据卫生部新近统计,我国每年出生婴儿约1600万,出生缺陷率约为4%-6%(即每年出生缺陷儿近百万),而这些数据仅显示了可见畸形的出生缺陷;此外,胎儿在宫内不良环境和母体异常因素影响下,原本正常发育的胚胎可在整体、器官、细胞、分子等水平发生一系列改变,这种改变有的并未造成解剖学上“可视性”的形态畸形,但会对出生后个体的健康问题埋下隐患,这即为目前医学研究领域极为关注的“胎源性疾病”(fetal origins of adult diseases,FOAD)问题。胎源性疾病(fetal origins of adult diseases,FOAD)是指宫内不良环境和母体异常因素(如高糖、高盐、营养不良、激素等)作用于胚胎发育的早期、胎儿等人类发育的早期阶段,导致幼儿发育的早期在细胞分子水平发生了相应的改变,继而对个体器官及整体系统的结构和功能产生长期的影响,使得胎儿成年后对某些疾病(高血压、糖尿病、肿瘤、精神疾病等)有较高患病率的现象。此概念的雏形最早见于David Barker教授在1989年的一项里程碑式的流行病学研究,证明出生时低体重和成年后心血管疾病死亡率之间存在着一定的正相关性,随后出现了大量的文献支持心血管疾病的发育起源的假说。认为“胚胎源性理论”(The Fetal Origins Hypothesis),亦是“印迹”(imprinting)效应理论。近六十年来,动物实验与临床研究不断发现新的证据支持和发展了这一理论。例如孕期高糖和高盐饮食均会对子代成年后的肾素血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)系统造成不可逆的影响,累及多系统多组织器官;以及本实验室最近的研究成果,母体孕期暴露于尼古丁可导致其子代成年后RAS系统发生变化,体现为多系统、多靶点(AT1及AT2受体在心脏、肾脏、脑等组织器官的表达,循环中RAS底物、关键酶及产物)均有改变。出生体重低于2500克的婴儿均称为低出生体重(Low Birth Weight,LBW)儿,通常由早产(Preterm Birth,PB)或宫内生长迟缓(Intrauterine Growth Retardation,IUGR)所导致。据统计,LBW发生率约为7%-15%,也是围产儿死亡的重要原因之一,LBW个体儿童期及成年期的发病率和死亡率也明显增加。因而,进一步认识和探讨这些疾病的原因及发病机制至关重要。充足的氧供是胎儿生长发育之必要元素,而妊娠期母体的多种生理因素或病理因素,诸如妊娠期高血压疾病、贫血、心衰、先兆子痫、肾功能衰竭、慢性肾炎、妊娠期糖尿病、慢性阻塞性肺疾患、过期产、吸烟、肺部疾病以及胎盘和脐带因素等疾病以及环境中不良因素均能使子宫胎盘血流减少,导致胎儿缺氧,影响胎儿正常生长发育,从而造成胎儿IUGR及LBW。机体的免疫系统维持正常的免疫功能,对完成机体的免疫防御、免疫稳定和免疫监视起着重要的作用,一旦免疫功能异常就会引起疾病,甚至是恶性肿瘤。胸腺作为中枢免疫器官,是T淋巴细胞分化和成熟的部位。T淋巴细胞数量或功能的异常会导致机体免疫功能的紊乱,是自身免疫性疾病、慢性感染性疾病以及恶性肿瘤等多种疾病发生发展的重要影响因素。长期以来,一直认为遗传和环境因素在恶性肿瘤和免疫性疾病的发生的关键因素。近年来,大量的流行病学研究表明宫内不良环境因素造成胎儿发育的“程序化机制”,导致子代罹患恶性肿瘤和免疫系统疾病的风险升高。白细胞介素2(IL-2)最早被称为T细胞生长因子,因在体外可促进淋巴细胞的免疫应答,在临床上曾被用来增强艾滋病患者或恶性肿瘤患者的T细胞免疫,或者通过阻断IL-2与其受体结合来抑制T细胞对移植物的免疫应答。HIF-1α/IKKβ/NF-κB和HIF-1α/MEK1/2/ERK1/2是细胞低氧条件下导致IL-2下调的两条重要信号通路。IL-2及其受体是否参与了孕期缺氧诱导的胸腺发育障碍及上述信号通路的关键蛋白在缺氧状态下是否发生变化也不清楚。目前,国外对胎儿宫内缺氧引起的“印迹”效应已有一些研究,但关于孕期缺氧对胎儿及子代胸腺发育的影响及其机制的研究尚未见报道。本课题拟采用孕BALB/c小鼠从妊娠第4天至妊娠第19天(GD4-GD19)缺氧(hypoxia)处理,建立孕期缺氧诱导IUGR小鼠模型,并在GD19时剖腹取出胎鼠,通过测量胎鼠形态学指标确定IUGR个体。取IUGR胎鼠胸腺,以正常组作为对照,采用HE染色法检测缺氧组胸腺组织结构的病理学变化;通过流式细胞术检测孕期缺氧的胎鼠及子代鼠中T淋巴细胞亚群的变化;再采用Real-time PCR方法和流式细胞术分析胸腺组织中细胞凋亡的情况;通过ELISA方法检测与胸腺发育有关的细胞因子的变化;用Real-time PCR和Western-blotting法对IL-2信号通路中关键蛋白进行检测。另外,借助胸腺器官体外培养的方法,外源性加入IL-2,测定缺氧环境下胸腺的发育状况,以期验证上述结论。从整体、组织器官、细胞及分子各水平,研究孕期缺氧对子代胸腺发育的影响,并初步探讨孕期慢性缺氧对子代胸腺发育障碍的机制。第一部分孕期缺氧对胎鼠和子代鼠形态学及胸腺发育和功能的影响目的:观察孕期缺氧对胎鼠和子代鼠形态学及胸腺发育和功能的影响。方法:选取清洁级BALB/c小鼠,孕鼠从妊娠第4天至第19天(Gestation Day,GD4-19)置缺氧箱(O2浓度为10.5%),建立LBW动物模型。缺氧期间每天称量孕鼠饮食量及体重,计算体重增长量。于GD19天,以剖宫术取胎鼠。以正常胎鼠做对照,测量胎鼠(GD19)的身长、尾长,称量胎鼠体重、脏器(心、肝、肾、肺、脑和胸腺)重量;用血气分析仪检测血气及血液离子等指标。对出生后第7天(PD7)仔鼠胸腺行常规组织切片,HE染色。流式细胞术检测不同发育时点(GD19、PD1、PD2、PD4、PD7和出生后第2周、第3周)外周血、胸腺和脾脏T淋巴细胞亚群情况。结果:与对照组相比,孕期缺氧对孕鼠饮食量有一过性影响,对体重增长量无明显影响,但可显著降低胎鼠的体重、心重、肝重、肾重及肺重;显著降低胎鼠血液中p O2、SO2%水平。组织病理学检查显示:缺氧组胸腺组织皮质区明显变薄,T淋巴细胞数量减少,髓质区扩大(P<0.05)。髓质区内未见极小的待发育的胸腺小体;流式结果显示:缺氧组胸腺组织中DP T淋巴细胞的百分比明显增加,SP T淋巴细胞的百分比显著减少(P<0.05),而外周血和脾脏SP T淋巴细胞的百分比也明显减少,与胸腺的发育过程基本一致且平行(P<0.05)。结论:孕期缺氧引起胎鼠和子代鼠胸腺发育障碍。第二部分孕期缺氧对子代鼠胸腺发育障碍的机制初探目的:探讨IUGR胎鼠及子代鼠胸腺发育障碍的分子机制。方法:选取PD7仔鼠的胸腺,应用Real-time PCR法检测Caspase-3和Ki-67的m RNA的表达水平,流式细胞术检测胸腺细胞的凋亡率;运用酶联免疫吸附实验检测胸腺组织中细胞因子IL-1、IL-2、IL-4、IL-7和IL-10的表达水平,应用Real-time PCR方法和Western blotting技术检测胸腺组织中IL-2信号通路中关键蛋白HIF-1α,IKKβ,NF-κB,MEK1/2,ERK1/2及其磷酸化水平后的蛋白变化情况。结果:与对照组相比,孕期缺氧能够显著增加凋亡诱导因子Caspase-3的表达(P<0.05),而增殖因子Ki-67的表达明显减少(P<0.05),显著增加胸腺细胞的凋亡率(P<0.05)。ELISA检测结果:缺氧组的IL-2表达量明显下降(P<0.05),IL-4和IL-7显著上升(P<0.05),而IL-1和IL-10无统计学差异(P>0.05)。Western blotting结果提示:缺氧组HIF-1α、IKKβ较对照组显著升高(P<0.05),NF-κB、MEK1/2、ERK1/2明显下降(P<0.05)。磷酸化的NF-κB蛋白和磷酸化的ERK1/2蛋白表达显著下调(P<0.05)。结论:孕期缺氧可能通过激活HIF-1α/IKKβ/NF-κB和HIF-1α/MEK1/2/ERK1/2信号通路下调IL-2表达,从而导致子代的胸腺发育障碍。第三部分孕期缺氧对子代胸腺发育障碍机制的体外探讨目的:进一步验证IL-2信号通路对孕期缺氧的子代胸腺发育障碍的作用。方法:建立胸腺器官体外培养(FTOC)模型,通过流式细胞仪检测体外培养的胸腺器官各组T淋巴细胞亚群的变化;应用Real-time PCR法分别检测正常组和缺氧组IL-2α(CD25)、IL-2β(CD122)和IL-2γ(CD132)的m RNA表达水平。结果:流式细胞仪检测显示:加入外源性IL-2的缺氧组与对照组相比,DP(CD4+CD8+)T淋巴细胞明显增加(P<0.05),SP(CD4+CD8-和CD4-CD8+)T淋巴细胞明显减少(P<0.05);Real-time PCR法显示:与对照组相比,缺氧组的IL-2β(CD122)和IL-2γ(CD132)的表达量明显下调(P<0.05),而IL-2α(CD25)没有显著性差异(P>0.05)。结论:补充外源性IL-2并不能逆转T淋巴细胞在胸腺中的发育障碍,这一过程是不可逆的;孕期缺氧可能会受损IL-2受体,从而引起子代的胸腺发育障碍。