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紫云英苷,又名山奈酚-3-O-葡萄糖苷或者山奈酚-3-○-β-D-葡萄糖苷,是一种存在于多种传统中草药中的天然黄酮类化合物。研究表明,紫云英苷具有抗炎、抗氧化、抗病毒、镇痛、抗菌、抗过敏和抗肝毒等作用,因此受到广泛关注。然而,利用传统的有机溶剂提取法从植物中提取紫云英苷需要用到大量的有机溶剂和原材料,化学合成法的反应条件苛刻、复杂、副产物多,这些局限性在很大程度上限制了紫云英苷的工业化生产。利用酶促方法在体外合成药用化合物具有立体选择性、绿色、环保、经济、简便等优点,可弥补前两种方法的不足,因而具有良好的应用开发前景,然而该领域在国内尚属空白。本研究旨在建立一种体外酶促合成紫云英苷的方法,以替代传统的有机溶剂提取法和化学合成法。首先,参照黄酮类化合物的合成途径,设计了一条体外酶促合成紫云英苷的途径,其中包括糖原磷酸化酶(GP)、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(GalU)、黄烷酮-3-羟化酶(F3H)、黄酮醇合酶(FLS1)以及类黄酮-3-O-糖基转移酶(UGT78K2),并将编码这5种酶的基因克隆至原核表达载体pET-32a或pGEX-5X-1。将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,再利用镍或谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化可溶性表达的融合蛋白。SDS-PAGE电泳结合考马斯亮蓝染色显示,蛋白的纯度达90%以上。然后,将纯化的融合酶蛋白在体外与相应底物进行反应,并利用聚酰胺薄层色谱法和高效液相色谱法分析其酶活,同时利用液质联用仪对反应产物进行鉴定。结果显示,纯化的6种融合酶蛋白GP、GalU、F3H (At)、F3H (Gm)、FLS1和UGT78K2都能将其底物转化为相应的产物,比活力分别为59.50 IU/mg、31426.77 IU/mg、309.61 IU/mg、659.21 IU/mg、4374.45 IU/mg和271.81 IU/mg。参照文献报道的反应条件,并经过进一步优化,这5种融合酶蛋白可在同一反应体系中将原材料柚皮素和糖原直接转化为紫云英苷,且反应产物经Sephadex LH-20凝胶柱层析和高效液相色谱分离后,最终获得的紫云英苷纯度高达94.11%。最后,通过超氧阴离子和DPPH自由基清除实验比较分析酶法合成和天然提取的紫云英苷的抗氧化活性。结果显示,用这两种方法获得的紫云英苷的抗氧化活性没有显著性差异(p>0.05)。终上所述,本文开发了一种体外合成紫云英苷的新方法,并对合成的紫云英苷的抗氧化活性进行了初步研究,为紫云英苷的工业化生产提供技术手段,对其它黄酮类药物的开发和利用具有指导意义。