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微卫星DNA是理想分子标记之一,广泛地应用于食品跟踪、群体遗传多样性等领域。中华绒螯蟹是绒螯蟹属中最具经济价值品种,为我国重要水产养殖和遗传保护对象。有关中华绒螯蟹遗传标记研究较薄弱,处于起步阶段,对于个体鉴定和跟踪还有较远距离。本研究首次采用磁珠富集法构建中华绒螯蟹微卫星文库,分离微卫星;在此基础上,采用荧光标记和毛细管电泳技术,分析微卫星特征并构建复合PCR高效扩增系统;应用所得标记,分析中华绒螯蟹的群体遗传多样性和个体识别;本研究还采用实时PCR技术首次报道中华绒螯蟹的基因组大小。1.中华绒螯蟹微卫星DNA文库的构建中华绒螯蟹微卫星的单富集文库主要构建过程有高分子量基因组DNA经Rsal消化、连接接头、PCR扩增、变性、Dynabeads?磁珠杂交和捕获、转化、克隆PCR、测序及序列分析等过程。为提高效率,对磁珠一次杂交后捕获的回收片段再次富集,构建双富集文库。测序结果表明,磁珠富集法比传统文库筛选法的微卫星分离效率高一个数量级,双富集文库中78.1%的克隆含有侧翼序列的微卫星。2.中华绒螯蟹微卫星的特征分析基于20个微卫星位点设计PCR引物,其中有14个位点在退火温度55℃、Mg2+的浓度为1.5mM能特异性扩增。采用FAM标记10个位点引物,HEX标记4个位点引物,PCR扩增经AcroprepTM过滤板吸附法快速提取的32个中华绒螯蟹样品基因组DNA。以分子长度标准ROX500为内标,PCR扩增产物经ABI3730XL毛细管电泳检测,Genemapper 3.5分析,结果表明毛细管电泳能精确检测微卫星的多态性。14个位点中ES10和ES26存在基因重复,ES38为单态位点,其它11个多态位点可以用于中华绒螯蟹的群体多样性的研究。3.荧光复合PCR的构建与优化将9个微卫星位点分成两组,5个位点用FAM（蓝色）标记,4个位点用HEX（绿色）标记;两种荧光类型分组优化,用琼脂糖胶电泳检测。随后,荧光标记的复合PCR扩增8个中华绒螯蟹样品的9个微卫星位点,采用毛细管电泳检测,调整各微卫星位点引物比例使所有位点均匀扩增。最后,逐一检测复合PCR基本参数对复合PCR产物的影响,优化PCR条件。结果表明荧光复合PCR的最优参数为dNTP 200μM、36个循环、Ta 55℃45s、退火时间为60s,摸板DNA20-500ng均可以稳定扩增。4.微卫星评估中华绒螯蟹的群体遗传多样性对无锡、苏州和上海的三个中华绒螯蟹群体共计102个样品,采用过滤板AcroprepTM吸附基因组DNA,使用已经特征分析的11个微卫星标记对基因组DNA进行PCR扩增,PCR产物经毛细管电泳检测。位点ES37可能存在无效等位基因,其余10个位点分析统计结果为:平均每个位点有高达22.9个等位基因,PIC和E值分别高达0.826和7.700,这一结果清楚表明中华绒螯蟹群体具有较高的遗传多样性。欧氏遗传距离和遗传相似性平均值分别为0.439和0.825;瓶颈分析表明有必要对中华绒螯蟹采取科学的品种保护计划。5.中华绒螯蟹的个体来源识别初步分析应用GeneClass 2.0软件,比较频率法、贝叶斯法、DAS、标准内氏、最小内氏、内氏DA、Cavalli-Sforza和Goldstein等8种个体来源识别不同算法,结果表明贝叶斯法识别率最高,达93.14%;单一微卫星位点的个体识别分析表明,等位基因数最多的ES35标记个体识别能力最高,达87.25%;选择多态性高的微卫星位点,有助于减少微卫星位点的使用数量,且不降低个体正确识别率。6.实时PCR测定中华绒螯蟹基因组大小以已经测序的水稻样品（Nipponbare）为对照,建立一种实时PCR方法定量检测中华绒螯蟹基因组大小。整个过程约120 min,PCR效率为97.8%。标准曲线为Y=-3.768X+44.568,标准曲线的相关系数（R2）为0.992,结果表明中华绒螯蟹的基因组大小（c值）为1.72±0.25pg。研究不仅首次报道了中华绒螯蟹的基因组大小,还表明基于SYBR GreenI的定量PCR方法可为基因组大小的定量检测提供了一种特异、快速和简洁的方法。