利用农业废弃物秸秆转化制备乙醇不仅可以减少环境污染,还能缓解能源紧张。由于物理、化学预处理和酶水解成本高,本课题期望在不加商业酶的条件下,利用多种微生物分步发酵秸秆的方式产乙醇,以降低乙醇转化的成本、减少环境污染。本课题以玉米秸秆为原料,首先研究了不同真菌对玉米秸秆的预处理效果,确定了预处理的最佳菌种和最佳时间。其次,初步研究了树干毕赤酵母固态发酵预处理后秸秆产乙醇最适条件。最后,研究了里氏木霉发酵预处理后秸秆产纤维素酶的最优条件,产酶结束后加入酵母以不同方式发酵产乙醇,探索多菌分步发酵预处理后秸秆产乙醇的可行性。主要研究结果如下:1、利用平菇、里氏木霉及二者混合菌种分别预处理玉米秸秆15 d、30 d、45 d、60d后,不同真菌对玉米秸秆的预处理效果:(1)预处理过程产酶结果:在预处理期间,平菇产漆酶(Laccase,Lac)和锰过氧化物酶(Manganese peroxidase,MnP)能力最强,在30 d时Lac和MnP活力达到最大,分别为6.57 U/g、0.69 U/g。里氏木霉产木聚糖酶(Xylanase,Xyl)和纤维素酶(Cellulase,Cel)能力最强,在45 d时Xyl活力达到最大为3067.99 U/g,60 d时Cel活力达到最大为129.14 U/g。(2)预处理过程秸秆组分降解结果:混合菌预处理后的秸秆干物质降解率最大。对木质素降解能力是平菇>混合菌>里氏木霉,60 d时平菇组木质素降解率达到最大为32.22%,但从45 d到60 d,平菇组的纤维素和半纤维素降解急剧增加。降解半纤维素和纤维素的能力是里氏木霉>混合菌>平菇,60 d时里氏木霉组半纤维素和纤维素降解率达到最大,分别为45.17%、33.72%。预处理期间,平菇的选择性系数(Selectivity Index,SI)均大于1,优先选择降解木质素,且延长培养时间,平菇菌丝能在秸秆上发育成菇蕾和子实体。除15 d外,里氏木霉的SI均小于1,优先选择降解纤维素。混合菌除15 d外,SI均在1左右,降解纤维素和木质素近乎是同步的。(3)扫描电镜(Scanning electron microscope,SEM)观察微生物预处理后玉米秸秆表面结构变化:未处理秸秆细胞壁完整,表面平整光滑,结构致密。平菇处理后在秸秆维管束和基本组织细胞壁上产生了各种类型的裂缝、空穴和孔洞,里氏木霉处理后主要在基本组织细胞壁上出现了明显腐蚀溶解的区域,结构破损严重。(4)微生物法预处理对秸秆酶水解和固态发酵产乙醇的影响:从30 d到60 d,平菇预处理秸秆酶水解还原糖浓度和糖转化率均极显著高于其他两种微生物处理和未处理样品(P<0.01)。平菇预处理60 d秸秆酶水解后,还原糖浓度最高为13.36 g/L,糖转化率最高为63.06%,但预处理60 d秸秆酶水解还原糖浓度与45 d并无显著性差异。平菇预处理45 d后的秸秆经树干毕赤酵母固态发酵后,乙醇产率最高为0.035 g/g(以每克预处理后干基秸秆计),极显著高于未处理样品和其他两组预处理(P<0.01)。综合考虑,确定最佳的预处理菌种为平菇,最佳预处理时间为45 d。2、单因素试验初步确定树干毕赤酵母固态发酵玉米秸秆产乙醇最适条件:发酵基质为平菇预处理45 d的玉米秸秆,酵母接种量为10%,发酵培养基初始水分含量为75%,在28℃发酵7 d,乙醇产率最高为0.049 g/g。3、多菌分步发酵预处理后玉米秸秆产乙醇:根据单因素和正交试验结果得出里氏木霉发酵平菇预处理45 d后的秸秆产纤维素酶的最优条件:培养基初始pH 4.8,硫酸铵浓度3.5 g/L,秸秆底物浓度4%,里氏木霉接种量5%,28℃,150 r/min下摇瓶发酵7 d。里氏木霉产酶结束后接入酵母,在非等温同步糖化发酵(Non-isothermal simultaneous saccharification and fermentation,NSSF)下的乙醇产率远远高于同步糖化发酵(Simultaneous saccharification and fermentation,SSF)下的乙醇产率,产朊假丝酵母乙醇发酵产率最高为0.123 g/g。本课题利用多种微生物分步发酵秸秆的方式产乙醇,乙醇产率与一些物理化学预处理和酶水解工艺的乙醇产率相当,本课题的研究结果对低成本、低污染地利用玉米秸秆产乙醇具有一定的指导意义。