论文部分内容阅读
为了探究扩展青霉脂肪酶(PEL)静电网络对其自身催化特性的影响,本文利用定点突变技术,对PEL特定位点的氨基酸残基进行变换,并测定分析了脂肪酶突变体的酶学性质,主要内容包括:一、选点选取扩展青霉脂肪酶基因的16个位点:Asp44、Asp70、Asp74、Asp76、Glu83、Glul13、Glu127、Glu207、Arg63、Arg97、Arg101、Arg182、Lys16、Lys202、Lys219和Lys226。这16个位点,其中8个位点编码的氨基酸带负电荷(Asp和Glu),另外8个位点带正电荷(Arg和Lys),是PEL静电网络的重要组成部分。此外,所选的这16个位点都比较靠近PEL的盖子结构(67-75)或者活性中心(132Ser-241His-188Asp)。二、构建重组质粒PET-47b(+)-PEL-X(突变型)并预筛为了探究上述16个位点对PEL自身催化特性的影响,我们利用定点突变技术,逆转了其带电性质:将带负电荷的位点突变成带正电荷的Lys,将带正电荷的位点突变成带负电荷的Asp。成功构建突变体后,我们在E.coli.BL21(DE3)表达了脂肪酶突变体,结果表明,7个脂肪酶突变体表现了不同程度的活力,它们是Asp44Lys、Asp76Lys、Glu83Lys、Arg97Asp、Argl0lAsp、Lys202Asp 和 Lys219Asp,其余 9个脂肪酶突变体在三丁酸甘油酯鉴定板上几乎没有活力。随后,我们再次利用定点突变技术,对这9个没有活力的位点进行同性置换,即Asp(?)Glu或者Arg(?)Lys,在三丁酸甘油酯鉴定板上又获得了 3个有活力的脂肪酶突变体,即Lys16Arg、Glu113Asp和Lys226Arg。至此,总共获得10个有活力的脂肪酶突变体。三、有活力的脂肪酶突变体的真核表达及酶学性质探究将预筛获得的10个有活力的脂肪酶突变体,利用同样的定点突变技术构建相应的重组质粒pPIC3.5K-PEL-X(突变型),电转至毕赤酵母GS115,筛选获得其中5个突变体的高拷贝菌株。然后通过发酵获得较纯的酶液,测定分析各个脂肪酶突变体的酶学性质,结果如下:(1)Asp44Lys脂肪酶突变体Asp44Lys的表达量为0.06 mg/mL,只有野生型的30%;对4-硝基苯基棕榈酸酯的比活力为96 U/mg,是野生型的2.67倍;最适作用温度为32℃;最适作用pH为8.0,与野生型一样;不同pH处理后,在pH7.0达到最稳定状态;偏好短链的底物分子;经乙腈、丙酮以及乙醇处理后,相对残余活力分别是0%,29%和58%(野生型的分别为1%,32%和26%)。与野生型相比,其对乙醇有较好的耐受性。(2)Glu83Lys脂肪酶突变体Glu83Lys的表达量为0.11 mg/mL,只有野生型的55%;对4-硝基苯基棕榈酸酯的比活力为2928 U/mg,是野生型的81.33倍;最适作用温度为32℃;45℃处理10 min后的相对残余活力39%,是野生型的13倍;最适作用pH为8.0;耐受pH5.0-11.0,不同pH处理后,相对残余活力均保持70%以上,在对照中处于最稳定状态;嗜好长链的底物,对4-硝基苯基月桂酸酯(C12)和4-硝基苯基棕榈酸酯(C16)都有较好的活力;经乙腈处理后基本失活;经丙酮和乙醇处理和后,相对残余活力分别是对照的5.42倍和3.94倍,对二者的耐受性极好。(3)Arg97Asp脂肪酶突变体Arg97Asp的表达量为0.09 mg/mL,只有野生型的45%;对4-硝基苯基棕榈酸酯的比活力为63 U/mg,是野生型的1.75倍;最适作用温度为32℃;最适作用pH为7.0;不同pH处理后,在pH7.0达到最稳定状态;偏好短链的底物分子;经乙腈、丙酮以及乙醇处理后,相对残余活力分别为0%,67%和33%,对丙酮的耐受性较好。(4)Arg101Asp脂肪酶突变体Arg101Asp的表达量为0.24 mg/mL是野生型的1.2倍。对4-硝基苯基棕榈酸酯的比活力为27U/mg,只有野生型的75%;最适作用温度为36℃;最适作用pH为7.0;不同pH处理后,在pH7.0达到最稳定状态;偏好短链的底物分子;经乙腈、丙酮以及乙醇处理后,相对残余活力分别为40%,60%和20%,对丙酮的耐受性较好。(5)Lys226Arg脂肪酶突变体Lys226Arg的表达量为0.32 mg/mL是野生型的1.6倍;对4-硝基苯基棕榈酸酯的比活力为21 U/mg,只有野生型的58.33%;最适作用温度为32℃;最适作用pH为8.0,与野生型一样;可以耐受pH5.0-11.0,在对照中处于最稳定的状态;偏好短链的底物,对4-硝基苯基月桂酸酯(C12)也略有偏爱;经乙腈、丙酮以及乙醇处理后,相对残余活力分别为6%,21%和31%,对乙醇的耐受性较好。