第一部分Wnt5A基因沉默对黑素细胞功能的影响目的研究Wnt5A特异性siRNA转染原代人黑素细胞后,Wnt5A基因沉默对黑素细胞骨架蛋白和酪氨酸酶的影响,初步探索非经典的Wnt通路相关基因对黑素细胞骨架和黑素生成的影响。方法培养原代人表皮黑素细胞,将Wnt5A特异性siRNA通过脂质体法转染原代黑素细胞,采用实时荧光定量PCR确定转染效率最高的实验方案(包括剂量、siRNA、时间点)后,通过实时荧光定量PCR、蛋白印迹法测定Wnt5A转染效率、并检测下游ROR2、 Rac1、F-Actin、β-Tubulin及TYR的mRNA及蛋白表达,并通过细胞免疫荧光法观察细胞骨架蛋白表达情况。使用独立样本T检验或单因素方差分析法分析各组之间的差异。结果在siRNA转染细胞后,Wnt5A基因表达较空白对照及阴性对照组间均有明显下降,干扰效率达91.0%; Rac1基因表达显著高于阴性对照组,F-Actin、β-Tubulin及TYR基因表达在干扰组及对照组间均无明显差异；Wnt5A蛋白表达较空白对照及阴性对照组间均有明显下降,提示干扰成功,干扰效率达86.7%; TYR、 β-Tubulin蛋白表达比对照组明显升高,分别约为2.6倍、2倍；ROR2、 F-Actin蛋白表达较对照组略下降；Racl表达无明显差异。细胞免疫荧光实验未见细胞骨架较阴性对照组和空白对照组有明显差异。结论成功建立了Wnt5A特异性siRNA转染人黑素细胞使基因沉默的模型。Wnt5A特异性siRNA转染原代黑素细胞后,TYR及β-Tubulin蛋白表白升高,黑素细胞骨架无明显改变。第二部分Wnt5A基因过表达对黑素细胞功能的影响目的研究Wnt5A质粒转染原代人黑素细胞后,Wnt5A表达升高对黑素细胞骨架蛋白和酪氨酸酶的影响,初步探索非经典的Wnt通路相关基因对黑素细胞骨架和黑素生成的影响。方法培养原代人表皮黑素细胞,将合成的Wnt5A质粒通过脂质体法转染原代黑素细胞,采用实时荧光定量PCR法、蛋白印迹法确定最佳的实验方案后,通过实时荧光定量PCR、蛋白印迹法测定Wnt5A转染效率、并检测下游RO2, Racl、 F-Actin, β-Tubulin及TYR的mRNA及蛋白的表达,并通过细胞免疫荧光观察细胞骨架蛋白表达情况。使用独立样本T检验或单因素的方差分析法分析各组之间的差异。结果在Wnt5A质粒转染黑素细胞后,Wnt5A mRNA表达较空白对照及阴性对照升高达800倍,差异有统计学意义；Rac1、 F-Actin、及TYRmRNA表达较空白对照及阴性对照升高,差异有统计学意义；β-Tubulin mRNA表达较空白对照及阴性对照无显著性差异。Wnt5A蛋白表达较空白对照及阴性对照升高达4.2-5.4倍,提示转染成功；TYR蛋白表达较空白对照及阴性对照升高达3倍；Rac1、F-Actin蛋白表达较空白对照及阴性对照降低约50%；ROR2蛋白表达较空白对照及阴性对照降低约33.3%；β-Tubulin蛋白表达较空白对照及阴性对照升高约1.4倍。免疫荧光检测各组间绿色、红色荧光强度无显著差异,但质粒转染组细胞体积明显增大,树突数目明显增多,细胞骨架显著改变,表现为F-Actin强弱不一,纹理模糊,张力丝断裂,局部成团块状。结论成功建立了Wnt5A质粒转染人黑素细胞使基因过表达的模型。Wnt5A基因表达升高后,TYR的mRNA和蛋白表达均明显升高,可能促使黑素生成增加。Racl和F-Actin基因表达升高、蛋白表达降低,β-Tubulin蛋白表达升高,细胞体积增大、树突增多、骨架改变,可能有利于黑素小体的输送传递,参与色素沉着性疾病的发病过程。