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反式-4-羟基-L-脯氨酸（trans-4-hydroxy-L-proline）是一种重要的非天然氨基酸,广泛应用于食品、化妆品、医药和化工等领域,市场需求呈现逐年递增的趋势,目前国内市场售价高达60多万元/吨。生物转化法具有反应条件温和、反应速度快、环境友好和产物光学纯度高等优点,因此逐渐受到研究人员的重视。开发反式-4-羟基-L-脯氨酸的高效、低成本生产技术,是目前酶催化领域的一个研究热点。为了提高生物法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的效率,本工作对影响反式-4-羟基-L-脯氨酸生物合成的关键因素,包括关键酶脯氨酸-4-羟化酶的活力、生物转化体系和条件等进行了深入研究。本课题以实验室构建保藏的5株基因工程菌为研究对象,主要的研究内容和结果如下:（1）通过对实验室构建的5株脯氨酸-4-羟化酶重组大肠杆菌进行发酵培养、酶的诱导表达、SDS-PAGE和酶活力分析,筛选出3株成功表达脯氨酸-4-羟化酶的重组大肠杆菌,分别为:编号为17908的菌株E.coli BL21（pET28b-p4hP）,编号为17909的菌株E.coli BL21（pET28b-p4hBr）,编号为17911的菌株E.coli BL21（pET28b-p4hBa）,分别对这3株菌全细胞转化合成反式-4-羟基-L-脯氨酸的催化条件和反应体系进行了优化,确定了最佳的反应条件为:温度为35℃、缓冲液为pH6.5的2-（N-吗啡啉）乙磺酸（MES 80mM）,30℃过夜温育;确定了最佳的反应体系为:2-酮戊二酸浓度为8 mM,L-抗坏血酸浓度为6 mM,17908、17909最佳Fe2+浓度为0.8mM,17911最佳Fe2+浓度为1.2 mM左右。经过优化,在底物浓度为0.35 g/L的条件下,17908、17909、17911的全细胞转化产物浓度达到了34.86 mg/L,30.66 mg/L和31.43 mg/L,分别比优化前提高了32.25%、26.85%和24.77%。（2）为了增加脯氨酸-4-羟化酶的可溶性表达水平,选择带可溶性标签的pET32a（+）为表达载体对脯氨酸-4-羟化酶进行克隆表达,构建重组菌E.coli BL21（pET32a-p4hP）;为了增强酶的表达水平,在重组质粒pET28b-p4hP和pET32a-p4hP的基础上,分别将原来的T7启动子更换为双色氨酸启动子,构建了重组菌E.coli BL21（pET28b-ptrp2-p4hP）和E.coli BL21（pET32a-ptrp2-p4hP）;通过对重组菌蛋白表达情况和酶活力进行分析,发现E.coli BL21（pET28b-ptrp2-p4hP）和E.coli BL21（pET32a-ptrp2-p4hP）的脯氨酸-4-羟化酶几乎没有表达;而E.coli BL21（pET32a-p4hP）的可溶性蛋白表达水平比原始菌E.coli BL21（pET28b-p4hP）有较大改善,解决了脯氨酸-4-羟化酶可溶性表达水平低的问题;但全细胞转化合成反式-4-羟基-L-脯氨酸的能力并未有明显提高。（3）为了提高脯氨酸-4-羟化酶合成反式-4-羟基-L-脯氨酸的能力,采用点饱和突变的方法对17908、17909、17911的脯氨酸4-羟化酶进行分子改造。首先对脯氨酸-4-羟化酶进行同源建模和保守性氨基酸分析,确定待突变的位点;然后,设计包含突变位点的简并引物对带有脯氨酸-4-羟化酶基因的重组质粒进行PCR扩增,并转化到E.coli BL21中,构建突变酶的重组菌;对突变菌进行全细胞催化反应,通过氯胺T方法初筛和氨基酸分析仪检测产物浓度的方法复筛确定正向突变菌,结果表明,17909和17911的脯氨酸-4-羟化酶经突变后,均没有筛选到正突变株;而在17908脯氨酸-4-羟化酶P4HP 7个突变位点的突变库中,F137R和Y205K位点的突变使得脯氨酸-4-羟化酶酶活得到明显的提高,在0.35g/L底物条件下,生成的反式-4-羟基-L-脯氨酸浓度分别为55.09 mg/L和52.29 mg/L,比原始酶分别提高了58%和50%。利用AutoDock软件分子对接比较发现,突变后该酶的活性中心没有发生太大变化,酶活的提高可能是由于突变作用使蛋白晶体结构发生了轻微改变,增加了该酶与底物或辅底物的亲和力引起的。