目的:锰（Manganese,Mn）是一种常见的环境微量元素,也是哺乳动物正常生长发育过程的必需微量元素。除神经系统毒性外,Mn的缺乏或过量也影响哺乳动物生殖系统正常功能。有流行病学调查研究显示锰铁联合矿附近的学龄儿童有体内荷尔蒙紊乱以及性发育提前趋势,也有动物实验表明过量Mn可具有导致大鼠或者恒河猴性发育提前的作用,但机制尚不清楚。性发育启动的神经内分泌表现之一是下丘脑（preoptic area-anterior hypothalamus,POA-AH）区GnRH神经元的分泌活性增加进而转换为黄体生成素（luteinizing hormone,LH）的脉冲分泌引起生殖器官功能和形态发育启动的过程。刚出生时哺乳动物的GnRH神经元处于高度活跃状态,几个小时内即进入抑制状态。青春期得以启动,要抑制信号减少才得以实现。γ-氨基丁酸（gamma-amino butyric acid,GABA）作为中枢神经系统的一种主要的抑制性神经递质,在性发育启动过程中发挥重要调节作用。GABA主要通过下丘脑内的GABAAR发挥抑制GnRH分泌的作用,GABAAR是一类配体依赖性离子通道,包括很多复杂亚基,其中α1、α2、β3和γ2亚基表达在GnRH神经元细胞上。一氧化氮（nitric oxide,NO）具有非常广泛的生物活性,大量研究表明NO可以调节GnRH的释放,有研究表明GABAAR对一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）的合成具有调控作用,目前已经发现多种不同亚型的NOS,在神经系统内NOS1是主要关注的对象。N6-甲基腺苷（N⁶-methyladenosine,m⁶A）是真核生物m RNA中最丰富且保守的内部修饰,几乎存在于所有真核生物RNA中。可逆的mRNA甲基化修饰打开了研究真核生物转录后基因调控的新领域。脂肪量和肥胖相关蛋白（fat mass and obesity associated,FTO）做为第一个被发现的m6A去甲基酶,广泛表达在哺乳动物脑内。YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3作为m⁶A的“reader”蛋白可结合在m⁶A位点上发挥促进目标转录物降解或翻译的作用。m6A可以对mRNA进行修饰来调节mRNA代谢和翻译,从而使不同的m RNA走向不同的命运。本研究将首先观察Mn对未成年雌性大鼠的性发育启动及GnRH分泌的影响,其次分析GABAAR在其中的作用,最终阐明FTO经GABAAR参与Mn致青春启动提前中的作用与机制,为锰致生殖毒性的机制研究提供新的理论和实验依据。研究方法:1、选择出生后21天（PND21,50±5g）的雌性SD大鼠按体重均衡原则分为4组（n=12）,分别为对照组、和低、中、高染Mn组。其中1-4组分别灌胃给予生理盐水、2.5、5以及10 mg/kg的MnCl₂（0.2 mL/25g BW/day）。所有大鼠染毒时间均为PND 21-32。每日监测记录大鼠阴道开口、动情周期以及体重,于首个动情间期当日处死大鼠。腹主动脉采血,取子宫、卵巢、下丘脑组织称取重量。Real-time-PCR检测GABA_AR（α1,α2,β3和γ2）和GnRH mRNA表达水平,western blot检测GABA_AR（α1,α2,β3和γ2）蛋白水平。免疫荧光双染、HE染色、尼氏染色检测锰对POA-AH区病理形态和GnRH神经元上GABAAR的表达影响。ELISA试剂盒检测下丘脑内GnRH、血清中LH、FSH和INH-B的水平。电感耦合等离子体质谱仪检测下丘脑、卵巢和子宫内Mn含量。体外的细胞实验:首先利用CCK-8实验确定GT1-7细胞染毒剂量,接着将GT1-7细胞分为4组,分别给予0、50、100和200μM MnCl2处理,染毒培养24h后收集细胞,检测细胞GABAAR荧光表达水平。2、PND21天的雌性SD大鼠按体重均衡原则分为4组（n=12）,分别为对照组、高Mn组、isog组（GABAAR激动剂）、isog+Mn组。实验分干预和染毒两阶段进行,干预:第1-4组分别给与皮下注射生理盐水、生理盐水、isog和isog处理。注射容量为1 mg/kg。2小时后,第1-4组分别灌胃给予生理盐水、MnCl2、生理盐水、MnCl2处理。注射容量为10 mg/kg,染毒时间为PND21-32。采用Griess试剂检测下丘脑匀浆上清液中NO含量,western blot检测下丘脑NOS1蛋白水平,其余步骤和处理同上。将PND21天雌性大鼠含POA-AH的脑切片依次灌注ACSF、10μM Bic、5μM isog和400μM MnCl₂,利用MED64记录自发电信号和放电频率,检测Mn在POA-AH区所介导的电信号特征。3、GT1-7细胞染Mn后用dot blot检测总RNA m⁶A水平,MeRIP-qPCR检测GABA_Aα2的mRNA的m⁶A水平,western blot检测m⁶A去甲基化酶和“reader”蛋白表达含量。验证有效的siRNA,选取合适的剂量和转染时间。将siNC细胞分为对照组和染锰组,siFTO细胞分为对照组和染锰组,分别检测各组细胞的GABAAα2的蛋白表达水平、GABA_Aα2的m RNA的m⁶A水平、和GnRH m RNA水平。雌性SD大鼠（PND21,50±5g）按体重均衡原则分为5组,每组10只,分别为（1）对照组、（2）10 mg/kg Mn组、（3）MA2+Mn组、（4）isog+Mn组、（5）MA2+isog+Mn组。MA2是FTO的高选择性抑制剂。第（1）、（2）、（4）组大鼠在PND21时进行第三脑室脑立体定位注射1%DMSO,第（3）、（5）组大鼠脑立体定位注射MA2,恢复两天后,首先第（1）、（2）、（3）组皮下注射等剂量生理盐水,第（4）、（5）组皮下注射1mg/kg isog。2小时后第（1）组大鼠灌胃给予等剂量生理盐水,第（2）、（3）、（4）、（5）组灌胃给予10 mg/kg MnCl2,持续染毒10天（PND23-32）。后续检测指标参考第一部分动物实验。结果:1、随着染锰剂量的增加,大鼠阴道开口、首次动情期均显著提前,5 mg/kg与10 mg/kg Mn组体重在PND35以及首次动情间期时显著低于对照组。5 mg/kg和10 mg/kg Mn组子宫脏器系数显著高于对照组,Mn对子宫形态学、子宫内膜厚度指数、肌层厚度指数均无明显影响。随着染Mn剂量的增加大鼠卵巢表现为整体皱缩,黄体结构不平整,各级卵泡数量显著增加,囊性卵泡增加等特点,但对卵巢黄体数无显著影响。下丘脑GnRH激素、血清中LH、FSH以及INH-B激素随着染Mn剂量的增加都呈现逐渐增加趋势。下丘脑Mn含量随着染Mn剂量增高也随之增高,10 mg/kg Mn组显著高于对照组。子宫和卵巢组织Mn含量无显著差异。HE染色和尼氏染色显示10 mg/kg Mn组下丘脑组织病理损伤严重。下丘脑内GnRH mRNA表达量随着染Mn剂量的增加呈现升高趋势。CCK-8结果显示随着染Mn剂量的增加及时间的延长,GT1-7的细胞活力不断下降,具有剂量-时间反应关系,根据OD值,选择200μM MnCl₂染毒24h作为最大剂量和染毒时间。GT1-7细胞GnRH m RNA的相对表达水平随着染Mn浓度的增加逐渐增加。2、染Mn后各组GT1-7细胞以及大鼠下丘脑的GABAAR（α1,α2,γ2,β3）的mRNA表达水平表达无明显影响,但GABAAR蛋白表达水平、GABAAα2荧光强度随染Mn剂量的升高而降低。MED64检测PND21天大鼠急性脑片POA-AH区电信号发现灌注400μM MnCl2后GnRH的电信号在经过短暂的大幅度波动后（持续大概1-2s）,进入长时间的相对静止期。预处理GABAAR激动剂isog推迟Mn所致的大鼠阴道开口、首次动情期、首次动情间期提前作用,增加大鼠体重,降低子宫、卵巢脏器系数。与对照组相比,单纯染Mn组GnRH、LH、FSH和INH-B激素均显著升高,与单纯染Mn组相比,isog+Mn组GnRH、LH和INH-B的水平显著降低。与对照组相比,单纯染Mn组下丘脑GnRH的mRNA水平、NOS1蛋白水平及NO的浓度呈现显著增高趋势,与单纯染Mn组比,isog+Mn组的GnRH的mRNA水平、NOS1蛋白水平及NO浓度显著降低。3、随着染Mn剂量的升高,GT1-7细胞总RNA的m⁶A、GABA_Aα2的mRNA的m6A水平都显著降低,FTO的蛋白表达显著升高,而各组ALKBH5、YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3无统计学差异。大鼠染锰后下丘脑的FTO蛋白表达水平也显著升高。SiNC细胞染锰组与对照组相比GABAAα2蛋白表达水平、GABAAα2的mRNA的m6A水平显著降低,siFTO细胞的染锰组与对照组比以上指标无显著差异。SiFTO对照组与siNC对照组相比以上指标显著升高。SiNC细胞的染锰组与SiNC细胞对照组相比,GnRH mRNA显著升高,siFTO细胞的染锰组与siFTO细胞的对照组相比无统计学差异,siFTO细胞染锰组与siNC细胞的染锰组相比显著降低。与对照组相比10 mg/kg Mn组大鼠阴道开口、首次动情期、首次动情间期显著提前,MA2+Mn、isog+Mn组以及MA2+isog+Mn较对照组有延后趋势,尤其MA2+isog+Mn组大鼠延后趋势更明显。结论:1、过量MnCl2可以引起未成年雌性大鼠性发育启动提前。2、Mn通过降低雌性下丘脑POA-AH区的GABAAR蛋白表达或者干扰其信号功能从而刺激NO的生成进而增加GnRH激素的生成和释放。3、Mn通过FTO降低GnRH神经元上GABA_AR的m⁶A位点降低GABA_AR蛋白表达作用。研究发现锰暴露可以通过增加mRNA去甲基化酶FTO的表达降低GABAAR的mRNA的m6A水平,使下丘脑POA-AH区的GABAAR蛋白表达下降,进而使其对NOS/NO的抑制作用减弱,增加GnRH激素的生成和释放,调控性发育启动,引起雌性大鼠性发育启动提前。