杆状病毒是一类主要感染鳞翅目昆虫的囊膜DNA病毒,在其感染循环中通常产生两种类型的病毒粒子,一类是包涵体来源的病毒粒子(Occlusion-derived virus,ODV),一类是出芽型病毒粒子(Budded virus,BV)。家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)BV的囊膜蛋白GP64全长529个氨基酸,苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nucleopolyhedrovirus,Ac MNPV)BV囊膜蛋白GP64全长512个氨基酸。信号肽预测分析表明Bm NPV GP64相比于Ac MNPV GP64信号肽(signal peptide,SP)长18个氨基酸(N端1-18个aa,简称SPI)。已有研究发现,构建截短Bm NPV的GP64的1-18个氨基酸的瞬时载体,转染Bm N细胞,免疫荧光分析发现1-18个氨基酸的缺失会导致GP64蛋白的定位从细胞膜上异位到细胞质。本文介绍了杆状病毒感染机制、研究现状和应用;囊膜蛋白及其研究进展,信号肽和信号肽酶的应用及研究进展;以及国内外对不同信号肽引导蛋白分泌途径的研究进展,并深入研究了Bm NPV GP64信号肽N端序列长度在介导外源蛋白跨膜转运中的作用。1.本研究构建不同截短长度的Bm NPV GP64信号肽引导e GFP的瞬时表达载体,转染Bm N细胞,用R18标记细胞膜,Hochest标记细胞核,利用激光共聚焦显微镜观察e GFP的定位。结果表明,分别截短Bm NPV GP64 N区3、6、9、12、15、16、17个氨基酸的信号肽,均能介导e GFP蛋白定位于细胞膜上,而SPII引导e GFP的瞬时表达载体,e GFP蛋白均定位于细胞质。说明1-17个氨基酸缺失不影响e GFP定位变化,而当N端前18个氨基酸被截断后,则会改变e GFP的定位。2.定量分析截短不同长度GP64信号肽对外源蛋白表达分泌的影响。构建了携带不同长度GP64信号肽引导的荧光素酶(luciferase)瞬时表达载体,转染Bm N细胞,通过荧光素酶报告系统定量分析了细胞外及细胞内的Luciferase活性。结果显示分别截短GP64 N端3、6、9、12、15、16、17个氨基酸后,分泌到细胞外的Luciferase活性与总的细胞荧光素酶活性比率分别是18.97%、19.30%、18.92%、16.91%、19.87%、18.25%、17.89%,与全长的信号肽引导的Luciferase分泌率无显著差异,而SPII信号肽引导的Luciferase分泌仅为2.30%,差异性分析表明不同长度信号肽引导Luciferase的分泌与SPII引导的Luciferase的分泌存在明显差异。3.利用q PCR方法分析表明信号肽酶表达存在宿主差异性。将Bm NPV GP64全长信号肽(SP,即第1-36个氨基酸)、第1-18个氨基酸(SPI)及第19-36个氨基酸(SPII)引导的e GFP瞬时表达载体分别转染Bm N和Sf9细胞,以没有信号肽的e GFP瞬时表达为对照,利用q PCR对不同细胞中信号肽酶表达进行了定量分析。结果显示,在Sf9与Bm N细胞中,对照组、SP、SPI的相对表达量整体差别不大;但是SPII在Sf9细胞中的相对表达量分别为11.479、11.1、19.806、11.68,在Bm N细胞中的相对表达量分别为1.493、1.171、1.172、1.118,存在显著性差异。综上所述,本论文研究表明Bm NPV GP64信号肽引导蛋白分泌依赖于其信号肽N区的长度,当截短了N端18氨基酸(即去除n区),其引导蛋白分泌率明显降低。