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近年来,许多学者对食品腐败菌中群体感应(Quroum sensing,QS)现象产生兴趣。波罗的海希瓦氏菌(Shewanella baltica)为革兰氏阴性嗜冷菌,是多种海产品的特定腐败菌(Specific spoi1age organisms,SSO)。前期研究表明,大黄鱼源S.baltica中存在AI-2和二酮哌嗪类(Diketopiperazine,DKPs)信号分子,其中cyc1o-(L-Pro-L-Leu)外源刺激能够促进S.baltica的腐败能力。然而,S.baltica QS系统的分子信息及感应受体蛋白与其调控腐败基因的机制的研究较少。鉴于此,本研究以冷藏大黄鱼中分离鉴定的特定腐败菌 S.baltica SB11为研究对象,从生物信息学角度分析S.baltica LuxR家族蛋白和AI-2合成酶LuxS蛋白;构建和验证luxS基因缺失株,比较研究其对生长、生物被膜及致腐表型的影响;基于转录组学研究外源添加cyclo-(L-Pro-L-Leu)对S.baltica的基因表达及代谢通路的影响,旨在更加全面地了解S.baltica的QS系统,为新型保鲜剂的研发提供理论支持。主要结果如下:利用生物报菌法、高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)、气相色谱(GC)检测了S.baltica SB11培养上清中信号分子,发现S.baltica SB11 上清液中含有 AI-2 和 cyclo-(L-Pro-L-Leu)、cyclo-(L-Pro-L-Phe)信号分子,而无AHLs活性。生物信息学分析发现Sbalt S.BA175基因组中无luxI同源基因,而共发现11个luxR家族同源基因,其中8个LuxR家族蛋白与双组份系统相关,接着与8个已知的QS受体LuxR蛋白进行进化树和保守氨基酸分析,发现NCBI中蛋白序列号为AEG10146.1与AEG11800.1可能为LuxR solo蛋白,并在S.baltica SB11基因组中扩增出对应的lwxR基因。同时,在S.baltica SB11中扩增出luxS基因,由510个碱基即169个氨基酸构成,BLASTP结果表明其与S.baltica、腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)等LuxS蛋白氨基酸序列相似度较高,相似度均超过80%,与S.baltica BA175的LuxS蛋白氨基酸序列相似度更是达到100%。进化树及蛋白序列二级结构分析发现,S.baltica SB11 LuxS蛋白较为保守,拥有组氨酸(His-54)、组氨酸(His-58)和谷氨酸(G1u-57)与半胱氨酸(Cys-127)组成的二价锌离子的结合位点,以及对LuxS活性起重要作用的丝氨酸(Ser-6),组氨酸(His-11)和精氨酸(Arg-39),谷氨酸(G1u-93)等保守氨基酸,三维结构模拟显示该LuxS蛋白由4个α螺旋和5个β折叠片构成,两个亚基表面均有一个锌离子结合位点,与多种菌的LuxS蛋白空间结构相似。构建S.baltica SB11 luxS基因缺失株,采用PCR扩增与AI-2活性验证缺失株luxS基因已成功缺失,并比较分析在4℃以及28℃条件下野生株与缺失株的生长、生物被膜及胞外多糖形成和粘附能力、泳动能力、蛋白酶活性、腐败代谢物、蛋白表达的差异。研究发现,在4℃和28℃下S.baltica野生株SB11和luxS基因缺失株△SB11的生长无显著差异。相对于野生株,缺失株ASB11生物被膜的形成显著减少,4℃下培养96h后,其生物被膜总量只有野生株的80%,而在28℃下培养24 h后,其总量仅为野生株的72%。相似地,缺失株△SB11胞外多糖含量也显著低于野生株SB11(P<0.05),4℃条件下培养120 h仅为0.051mg/mL,而野生株为0.060 mg/mL,28℃条件培养24 h为0.056mg/mL,而野生株为 0.064mg/mL。同时,S.baltica luxS基因缺失株在不锈钢片上的粘附能力也明显减弱,在4℃下培养72 h,野生株与缺失株粘附量分别为7.25和6.78 Log10CFU/cm2,在28℃;培养24 h后粘附量分别达到6.85与6.40 Log10CFU/cm2。荧光显微镜观察显示,野生株SB11能快速粘附于盖玻片表面,聚集并形成大量生物被膜,而缺失株△SB11更倾向于形成平坦稀疏的生物被膜,而且细菌并不聚集成团。同时野生株和缺失株的泳动性存在差异(P<0.05).,4℃培养72 h后,突变株和的野生株扩散直径分别32.3和25.9 mm,28℃下培养48 h后其扩散直径分别为71.2和53.5 mm。然而,野生株SB11和缺失株ASB11在4℃和28℃条件下蛋白酶活性和腐败代谢产物三甲胺、腐胺的形成无显著差异。4℃冷藏条件下,鱼汁中细菌生长和挥发性盐基氮的积累,两株菌也无明显不同。结果表明,lwxS基因缺失减弱S.baltica的生物被膜和粘附能力,促进泳动性,但不影响S.baltica的致腐表型和能力。SDS-PAGE也显示与野生株相比,缺失株中蛋白表达发生变化,其蛋白质量主要集中在28～44.3 KDa,蛋白表达差异可能与生物被膜形成和泳动能力的变化存在一定相关。外源添加cyc1o-(L-Pro-L-Leu)不影响S.baltica.SB11的生长,对生物被膜形成、泳动、粘附能力、脂酶活性及三甲胺、挥发性盐基氮形成却有明显促进作用。转录组学分析显示,外源添加cyc1o-(L-Pro-L-Leu)在培养4 h和12 h后分别发现130个和89个显著性差异基因,其中培养4h及12h的处理组与对照组相比分别共有122个及65个基因上调,影响S.baltica核糖、碳代谢、脂肪酸代谢、双组份系统,鞭毛组装,细菌趋化等多条代谢通路。多种粘附相关基因,如调控细菌胞外蛋白纤维(Curli)CsgAB操纵子的转录管理基因、Type Ⅳ菌毛的稳定蛋白pilW基因及与荧光假单胞菌lapA同源的bpfA基因的表达均有明显上调,可能参与促进S.baltica SB11的粘附及定植作用。fliM、flgD、fli4、甲基受体趋化蛋白基因等多个鞭毛及趋化运动相关的基因上调,可能参与增强细菌的运动能力。研究也发现,c-di-GMP合成酶二鸟苷酸环化酶基因上调,该酶可以通过合成c-di-GMP促进生物被膜形成。同时在培养12h后,一些腐败相关基因如torF、torA、ODC等基因均有上调,与表型结果代谢产物的增加呈正相关。另外,转录组学分析显示外源添加cyclo-(L-Pro-L-Leu)4h后,LuxR蛋白(蛋白序列号为AEG11800.1)对应的基因表达量显著上升,表明该蛋白对cyclo-(L-Pro-L-Leu)具有感应,提示其可能为LuxR solo蛋白。实时荧光定量PCR结果显示外源添加cyclo-(L-Pro-L-Leu)培养4 h及12 h后,fliA、torA和ODC基因的表达量与转录组测序结果一致,表明转录组测序结果较为可靠。综上所述,腐败菌S.baltica SB11具有AI-2及cyclo-(L-Pro-L-Leu)、cyclo-(L-Pro-L-Phe)活性,发现该菌存在一个LuxR家族蛋白可能为QS受体LuxR solo蛋白,而LuxS蛋白较为保守,为LuxS蛋白家族的功能蛋白。luxS缺失株显著减弱生物被膜形成和粘附能力,但不参与调控该菌的腐败能力。外源cyclo-(L-Pro-L-Leu)能够增强S.baltica 致腐表型,转录组学分析提示这可能与cyclo-(L-Pro-L-Leu)添加后,粘附、泳动、腐败等相关基因的表达上调有关。