课题一:肺泡巨噬细胞Lkb1对其自稳的调控缺失。过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（peroxisome proliferator-activatedreceptor-γ,PPAR-y）的基因或蛋白表达水平在Cd11cCreLkb1f/f小鼠AM中均降低,其激动剂可部分挽救AM脂质堆积状态。结论:Lkb1在AM胞内糖脂代谢调节过程中起到了重要作用。ROS抑制剂或PPAR-γ激动剂可一定程度挽救Lkb1缺陷AM的比例或脂质堆积状态。第一部分Cd11cCreLkb1f/f条件敲除小鼠的建立及其免疫表型的鉴定目的:明确Lkb1在肺泡巨噬细胞（Alveolar Macrophage,AM）发挥免疫功能过程中的主要作用。方法:我们对小鼠DNA扩增后进行琼脂糖凝胶电泳以鉴定其基因型。对Lkb1f/f和Cd11cCreLkb1ff小鼠进行肺泡灌洗并取肺组织制备单细胞悬液以进行流式分析。用Click-iTTM Plus EdU试剂盒对细胞增殖情况进行检测。利用金黄色葡萄球菌经滴鼻建立肺炎模型。肺部巨噬细胞的去除根据Nano Sciences公司的巨噬细胞去除试剂盒说明书进行。两组独立连续变量之间的比较采用t检验。结果:经杂交我们构建了Cd11cCreLkb1ff条件敲除小鼠,检测结果显示相对于Lkb1ff小鼠,Cd11cCreLkb 1ff小鼠AM绝对数和比例显著降低,细胞凋亡增加（P<0.05）,但其前体巨噬细胞、单核细胞与胚胎巨噬细胞并未发生改变。肺炎模型结果表明相对于Lkb1ff小鼠或去除实验对照组,Cd11cCreLkb1ff小鼠或AM去除组肺部炎症更为严重,感染的病菌更多,中性粒细胞百分比增加,嗜酸性粒细胞百分比降低,差别具有统计学意义（P<0.05）。结论:Lkb1缺陷可致AM数目或比例严重缺失,这种缺失来源于AM自身凋亡或坏死细胞的增多,可使小鼠肺部易受病原体感染及中性/嗜酸性粒细胞比例失衡。第二部分代谢相关检测及Cd11cCreLkb1f/f小鼠AM挽救实验目的:探究Lkb1对AM代谢的影响,挽救Lkb1缺陷AM的缺失或其功能。方法:我们用流式或磁珠分选技术纯化AM。用油红O对细胞脂质进行染色。代谢组学分析基于气相色谱-质谱联用仪或多反应监测技术进行。用Seahorse XF技术对细胞代谢状况进行分析。细胞基因水平检测采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）技术。蛋白水平检测采用蛋白印迹法。活性氧水平经检测试剂盒获得。免疫表型相关检测经流式分析得到。配对实验设计采用配对检验,两组独立样本之间的比较采用t检验。结果:相对于Lkb1ff小鼠,Cd11cCreLkb1ff小鼠AM呈脂质堆积。代谢组学分析结果显示Cd11cCreLkb1ff小鼠AM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD）等的检测水平相对于Lkb1ff小鼠AM下调,而亚油酸、油酸和β-D-果糖-6-磷酸盐等上调,差别具有统计学意义（P<0.05）。Seahorse XF实验结果显示Cd11cCreLkb1ff小鼠AM糖酵解过程活跃,呼吸能力增强,ATP产生增加。活性氧（reactiveoxygen species,ROS）检测显示Lkb1缺陷的AM其ROS产生增加,用ROS抑制剂可一定程度挽救Cd11cCreLkb1ff小鼠AM 比例的第三部分Lkb1缺陷的肺泡巨噬细胞中重要的信号通路及基因目的:探究Lkb1缺陷对AM重要基因转录水平的影响及相关通路的变化。方法:我们利用流式分选技术分选出AM细胞后进行RNA-seq分析,测序平台为BGISEQ-500。用Cytohubba插件进行关键基因的筛选。热图由R软件获得。结果:差异基因（Cd11cCreLkb1f/f vs Lkb1f/f）主要富集在炎症反应、甘油脂代谢、脂质储存等通路,这些通路中募集到的几乎所有基因在Cd11cCreLkb1f/f小鼠AM中均表达上调。关键基因评分结果表明C-X-C基序趋化因子受体2（C-X-C motif chemokine receptor 2,CXCR2）,Toll 样受体 2（Toll like receptor 2,TLR2）,丝裂原激活的蛋白激酶 3（mitogen-activatedproteinkinase3,MAPK3）,CD40,趋化因子（C-C 基序）受体 7（chemokine（C-C motif）receptor7,CCR7）等基因相对重要且在Cd11cCreLkb1f/f小鼠AM中表达增高。基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）得到了与Cytoscape相同的炎症反应和代谢相关通路的结果。结论:Lkbl缺陷的AM其炎症反应及甘油脂代谢等通路相关基因上调,一些关键基因如TLR2,CD40,CCR7等可能在此过程中起到了重要作用。课题二:胃癌与黑色素瘤表观遗传学相关研究第一部分 胃癌患者DNA甲基化亚分型及预后评估模型的构建目的:根据胃癌DNA甲基化亚分型,建立预后评估模型以预测高风险胃癌患者,为临床诊治提供依据。方法:我们利用Cox风险回归的方法确定独立预后相关甲基化位点并进行患者亚分型,用coxph函数构建风险评估模型。基因通路富集在Cytoscape软件进行。相关性分析采用Spearman或Pearson分析。两组或两组以上独立样本之间的比较选择参数或非参数统计学检验。结果:我们鉴定出了610个胃癌独立预后相关甲基化位点（P<0.05）,将胃癌患者分为7个甲基化亚组,并利用甲基化水平和患者生存率高于其他亚组的第6亚组中显著变化的甲基化位点（P<0.05）构建了预后风险评估模型。该模型能够有效地将高风险和低风险的胃癌患者进行区分,受试者工作特征曲线下面积大于0.90,其有效性在另一组胃癌患者甲基化样本中得到了证实。独立预后相关甲基化位点对应的基因主要富集在癌症通路或胃癌信号通路。其中,转化生长因子β2（transforming growth factor β2,TGFβ2）在不同的胃癌患者生存状态、T分期、分级和肿瘤阶段的表达水平存在差异,并且相对于正常人,在肿瘤患者中的表达水平升高,参与了该病信号通路。结论:我们实现了基于甲基化大样本的胃癌亚分型并构建了能够有效识别高风险患者的预后风险评估模型。一些重要的独立预后甲基化位点对应的基因例如TGFβ2被发现,这些基因将会为胃癌患者临床诊治和个性化风险评估提供新的依据和思路。第二部分黑色素瘤患者DNA甲基化亚分型及预后评估模型的构建目的:通过建立黑色素瘤DNA甲基化亚分型构建预后风险评估模型并挖掘重要的独立预后相关甲基化位点对应的基因。方法:我们基于475个黑色素瘤患者甲基化文件,利用Cox风险回归方法鉴定独立预后相关甲基化位点进而进行亚分型。利用R软件进行风险评估模型构建,用ClueGo对位点基因进行通路富集。根据数据是否满足正态分布及方差齐性选择参数或非参数统计学检验。结果:我们鉴定出了 256个黑色素瘤独立预后相关甲基化位点（P<0.0001）,并将患者分为7个甲基化亚组,这些亚组中第2亚组的甲基化水平和生存时间显著低于其他组（P<0.05）。于是我们将第2亚组中显著变化的甲基化位点用于黑色素瘤患者预后风险评估模型的构建,该模型能够有效地将患者分为高风险组和低风险组,具有较高的检测效率,受试者工作曲线下面积为0.833。经分析我们发现,随着风险值的升高,死亡患者数目逐渐增加,患者甲基化水平逐渐降低,有高风险分数的患者生存率远低于有低风险分数的患者。相关性分析结果显示,黑色素瘤患者的风险值与生存时间呈负相关（rs=-0.325,P<0.0001）。独立预后相关甲基化位点对应的基因主要富集在癌症和免疫相关通路。在这些位点基因中,我们鉴定出35个关键基因,其中DOK2、GPBAR1、GBP4、PSMB9等基因在不同甲基化亚组、患者生存状态、肿瘤阶段和临床T分期中的表达水平存在显著性差异且呈正相关（P<0.05）。结论:我们实现了基于大样本的黑色素瘤甲基化亚分型并构建了具有较高检测效率的预后风险评估模型,同时发现了几个重要的与患者预后情况存在显著相关性的位点基因,这些基因之间呈明显的正相关,说明其可能通过协同作用共同促进了黑色素瘤疾病的形成过程,这对于进一步理解黑色素瘤疾病分子生物学机理具有重要意义,为临床诊治提供了新的靶点。第三部分 m6a调控基因在黑色素瘤患者中的表达情况及意义目的:探索RNA表观修饰N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m6a）调节基因在黑色素瘤疾病形成过程中的重要作用。方法:我们利用Oncomine数据库对m6a的调控基因的表达水平进行了分析,并在基因表达综合数据集（gene expression omnibus dataset,GEO）中进行了验证。关键基因通过Cytohubba获得。利用cBioPortal线上工具对基因突变情况进行分析。结果:我们发现YTHDF1和HNRNPA2B1在黑色素瘤患者中表达上调,对这两个基因进行联合回归分析发现检测效率相比较于单个基因提高了约10%。黑色素瘤转录本中关键基因的功能富集结果表明,p53信号通路中包括了 CDK2,CDK1,RRM2,CCNB1和CHEK1等基因。这五个基因与YTHDF1或HNRNPA2B1呈正相关,这意味着这两个m6a调节基因可能通过影响上述5个关键基因的m6a修饰而调节其表达进而促进其抑制p53信号通路。我们还发现YTHDF1和HNRNPA2B1主要的变异是扩增,且携带m6a调节基因突变的患者与不携带突变的患者在不同的肿瘤阶段和治疗反应组中有显著差别。结论:我们第一次利用m6a调节基因联合回归的方法对黑色素瘤患者进行诊断鉴别。同时,我们发现YTHDF1和HNRNPA2B1表达水平在黑色素瘤患者中显著改变且可能通过p53等信号通路影响了患者的疾病进展。