【摘 要】
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背景香烟烟雾（Cigarettesmoke,CS）暴露是脂代谢异常和动脉粥样硬化性血管疾病的重要危险因素,但是吸烟对脂代谢及动脉壁脂质沉积影响的具体机制尚不清楚。目的研究CS暴露对小鼠脂代谢和动脉壁脂质沉积的影响及其可能的分子机制以及褪黑素的保护作用。方法第一部分1.利用C57BL/6J小鼠构建动物模型,分设三个实验组:CS暴露组、褪黑素保护组、对照组。采用全自动生化分析仪测定小鼠血脂,免疫组化评
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背景香烟烟雾（Cigarettesmoke,CS）暴露是脂代谢异常和动脉粥样硬化性血管疾病的重要危险因素,但是吸烟对脂代谢及动脉壁脂质沉积影响的具体机制尚不清楚。目的研究CS暴露对小鼠脂代谢和动脉壁脂质沉积的影响及其可能的分子机制以及褪黑素的保护作用。方法第一部分1.利用C57BL/6J小鼠构建动物模型,分设三个实验组:CS暴露组、褪黑素保护组、对照组。采用全自动生化分析仪测定小鼠血脂,免疫组化评估小鼠主动脉中CD68和ICAM-1的表达情况,并使用WB（Western blot）技术分析小鼠肝脏中低密度脂蛋白受体（Low-density lipoprotein receptor,LDLR）和前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶 9（Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9）的表达水平,研究CS暴露对脂代谢的影响。2.通过HepG2细胞培养,利用CS萃取剂（CS extract,CSE）处理HepG2细胞,分别采用CCK-8试剂盒检测细胞活力,2,7-二氯荧光素二乙酸酯荧光探针测定细胞内总的活性氧（Reactiveoxygenspecies,ROS）含量,RT-qPCR和WB等技术检测LDLR和PCSK9基因和蛋白的表达情况。第二部分1.利用Apo-/-小鼠构建动物模型,同样分为三组,分别采用免疫组化染色评估小鼠主动脉中B组1型清道夫受体（Scavenger receptor class B type 1,SR-B1）和CD31的含量,油红O染色评估动脉壁脂质沉积情况,二氢乙啶检测主动脉ROS水平,研究CS暴露对血管壁脂质沉积的影响。2.通过人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）培养,使用CSE处理HUVECs细胞,用CCK-8试剂盒检测细胞活力,WB检测SR-B1的表达,Transwell技术评估HUVECs细胞对LDL-C转胞吞作用。3.分别收集吸烟和不吸烟的颈动脉内膜切除术患者斑块标本各5例,采用免疫组化和WB检测斑块中SR-B1的表达差异。结果第一部分CS暴露组小鼠血清中总胆固醇（Totalcholesterol,TC）、甘油三酯（Triglycerides,TGs）和低密度脂蛋白胆固醇（Low-densitylipoproteincholesterol,LDL-C）的水平以及动脉壁CD68和ICAM-1表达显著高于对照组（P<0.05）,肝脏中LDLR的表达明显低于对照组（P<0.05）;褪黑素组小鼠血清中TC,TGs和LDL-C的水平及动脉壁CD68和ICAM-1表达较CS暴露组显著降低（P<0.05）。使用CSE处理HepG2细胞,发现LDLR的表达降低,PCSK9表达升高。ROS清除剂NAC或NF-κB抑制剂BAY11-7082或褪黑素预处理可显著减弱CSE诱导的PCSK9和LDLR表达的变化。SIRT1抑制剂Inauhzin可以阻断褪黑素的调节作用。第二部分与对照组相比,CS暴露组动脉壁脂质沉积显著加重（P<0.05）,动脉壁SR-B1和CD31表达以及ROS水平明显增加（P<0.05）。褪黑素组动脉壁脂质沉积明显减轻（P<0.05）,动脉壁SR-B1和CD31表达以及ROS水平显著降低（P<0.05）。细胞实验发现CSE可促进HUVECs细胞中SR-B1高表达,并增强对LDL-C的转胞吞作用,褪黑素可以抑制HUVECs细胞SR-B1的高表达,并减弱对LDL-C的转胞吞作用。临床探索性研究发现在吸烟和不吸烟患者的颈动脉斑块中均有SR-B1的表达,但是吸烟患者斑块中的表达量显著高于不吸烟患者（P<0.05）。结论CS暴露可通过降低肝细胞表面LDLR的表达导致循环中LDL-C水平升高,并增加血管内皮细胞SR-B1的表达促进脂质在动脉壁的沉积。褪黑素可以抑制PCSK9的表达,增加肝细胞LDLR的含量,调节CS暴露导致的血脂异常,还可通过抑制SR-B1的表达,减弱血管内皮细胞对LDL-C的转胞吞作用,并减轻动脉壁的脂质沉积。本研究揭示了 CS暴露加重动脉粥样硬化的新机制,有望成为治疗CS暴露后血管病变的靶点。
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