新孢子虫是一种细胞内寄生虫,主要引起牛、羊等中间宿主的孕畜流产,及终末宿主犬等动物的神经系统疾病。新孢子虫病呈世界性分布,是造成养牛业繁殖障碍疾病的主要原因之一,每年给养殖业带来巨大经济损失。但是到目前为止,尚缺乏有效的化学药物或商品化疫苗用于防治该病。如今人们把越来越多的目光集中于新孢子虫与宿主之间的免疫应答研究。新孢子虫速殖子在中间宿主体内的快速增殖及转移是造成新孢子虫病急性期感染的主要原因;而宿主的先天免疫应答反应在对入侵病原的识别、应答及介导获得性免疫应答进而促进病原清除中起到了至关重要的作用,其中先天免疫细胞表达的病原模式识别受体（PRR）是发挥作用的第一步。胞内增殖是新孢子虫感染中的重要过程,而宿主的胞内PRRs是如何参与识别新孢子虫,尚缺乏详尽报道。除了NOD2,NLRs家族中其它分子是如何参与抗早期新孢子虫感染尚未见报道。本课题以小鼠和牛的巨噬细胞等和新孢子虫速殖子为研究对象,筛选出参与识别新孢子虫表达变化最明显的NLRP3分子,然后利用NLRP3,ASC,caspase-1/11及GSDMD基因缺失小鼠深入研究NLRP3炎症小体在抗新孢子虫感染中的作用,并阐明其调控机制,以期为新孢子虫病的防治提供理论指导。NLRs中参与识别新孢子虫的分子种类鉴定。用荧光定量PCR及Inflammasome RT Profiler PCR Arrays鉴定NLRs家族中参与识别新孢子虫的分子种类,结果表明新孢子虫能以不同感染时间使NLRs家族中多种分子表达上调,其中传感蛋白NLRP3基因上调最为明显,为进一步探索NLRP3介导的炎症小体反应奠定基础。新孢子虫激活NLRP3炎症小体反应的检测。通过Western Blot检测炎症小体反应中的IL-1β成熟分泌、caspase-1活化及NLRP3表达情况,利用ELISA方法测定细胞上清中分泌的IL-1β,用细胞免疫荧光检测NLRP3在新孢子虫感染细胞后的形态变化;同时利用相关抑制剂及Nlrp3^-/-小鼠细胞验证新孢子虫诱导的炎症小体反应。结果表明新孢子虫感染小鼠腹腔巨噬细胞后可诱导炎症小体介导的IL-1β成熟分泌和caspase-1活化,且反应呈感染时间和感染剂量依赖性;当新孢子虫感染巨噬细胞后NLRP3在细胞内由弥散状态变为高亮的点状,说明NLRP3炎症小体可被新孢子虫激活;当使用caspase-1,泛caspase和抑制NLRP3炎症小体激活的抑制剂,新孢子虫诱导的IL-1β成熟分泌显著减少或消失,同时新孢子虫感染Nlrp3^-/-巨噬细胞后IL-1β成熟分泌和caspase-1活化极显著减少。以上结果说明新孢子虫可激活NLRP3炎症小体,为继续探索其作用及机制奠定基础。新孢子虫激活牛炎症小体反应的检测。牛是新孢子虫感染的自然中间宿主,了解新孢子虫激活牛先天免疫细胞中炎症小体的情况对继续利用小鼠深入研究炎症小体在新孢子虫感染中作用机制至关重要。利用牛外周血单核/巨噬细胞及牛腹腔巨噬细胞细胞系（Bo Mac）和新孢子虫速殖子构建感染模型,检测IL-1β成熟分泌和caspase-1活化情况。结果发现新孢子虫可诱导牛外周血单核/巨噬细胞的IL-1β成熟分泌,说明新孢子虫可激活牛的炎症小体。然后利用Bo Mac细胞对炎症小体的作用继续进行相关研究,结果发现新孢子虫可诱导Bo Mac细胞中的caspase-1活化,利用caspase-1抑制剂处理细胞后发现新孢子虫诱导的细胞死亡减少,说明新孢子虫也可激活Bo Mac细胞中的炎症小体,且可诱导caspase-1介导的细胞焦亡。当炎症小体反应被抑制后Bo Mac细胞中新孢子虫数量增多,而当加入ATP诱导炎症小体反应后细胞中新孢子虫数量减少。同时发现Bo Mac细胞发生焦亡后,其释放的上清对新孢子虫具有损伤作用,可降低新孢子虫在Bo Mac细胞中的数量。以上结果说明新孢子虫可激活牛的炎症小体,且该反应可促进清除细胞内的新孢子虫,为继续利用试验动物小鼠进行深入研究奠定基础。NLRP3炎症小体在抗新孢子虫感染中的作用及机制。利用NLRP3,ASC,caspase-1/11基因缺陷小鼠检测NLRP3炎症小体在新孢子虫早期感染中的作用。结果发现新孢子虫感染骨髓源巨噬细胞后可通过K⁺外流信号促进炎症小体诱导炎症小体介导的caspase-1活化、IL-1β和IL-18成熟分泌及细胞焦亡;且该反应依赖于NLRP3,ASC,caspase-1/11。然后分别用WT小鼠及NLRP3,ASC,caspase-1/11基因缺陷小鼠感染新孢子虫,结果发现NLRP3,ASC缺失后小鼠存活显著减少;ASC,caspase-1/11缺失后脑组织中新孢子虫数量增多;非常有意思的是在WT小鼠血清中未检测到IL-1β,但可检测到高水平的IL-18。同时发现新孢子虫诱导的IFN-γ分泌及炎症小体介导的IL-18分泌依赖于ASC和caspase-1/11,部分依赖于NLRP3;当分别缺失NLRP3,ASC,caspase-1/11后,小鼠腹腔中单核/巨噬细胞和粒细胞数量显著增多,但新孢子虫数量也增多。以上结果说明NLRP3炎症小体成分NLRP3,ASC,caspase-1/11在保护宿主、控制新孢子虫转移中发挥不同作用;NLRP3炎症小体参与调控新孢子虫诱导的IL-18和IFN-γ分泌,促进宿主抗新孢子虫感染的Th1免疫应答,同时促进巨噬细胞等免疫细胞对新孢子虫的清除作用。同时提示炎症小体介导的细胞焦亡在清除新孢子虫中可能发挥作用。细胞焦亡在抗新孢子虫感染中的作用。用新孢子虫感染细胞焦亡执行蛋白GSDMD基因缺失小鼠和WT小鼠,探索细胞焦亡是否有利于清除新孢子虫。结果发现Gsdmd^-/-小鼠存活显著降低;组织中新孢子虫数量显著增多;血清中IL-18及IFN-γ分泌显著减少;初始感染部位腹腔中单核/巨噬细胞和粒细胞数量显著增多,但新孢子虫数量也增多。GSDMD基因缺失小鼠回补重组IL-18,进一步探索IL-18在抗新孢子虫感染中的作用。结果发现与Gsdmd^-/-小鼠相比,回补组小鼠腹腔灌洗液中IL-18含量显著增多,血清中IL-18和IFN-γ分泌显著增加,但腹腔灌洗液细胞中新孢子虫数量显著减少;与WT小鼠相比,回补组小鼠血清中IFN-γ分泌无差异,且腹腔灌洗液细胞中新孢子虫数量无差异。以上结果说明GSDMD介导的细胞焦亡在新孢子虫感染中利于保护宿主,促进清除免疫细胞中的新孢子虫及控制新孢子虫向其它组织转移;同时通过介导IL-18分泌促进清除新孢子虫,且诱导血清中IFN-γ的分泌,促进宿主抗新孢子虫感染的Th1免疫应答。综上所述,本研究首次发现NLRP3炎症小体可被新孢子虫激活,介导caspase-1活化促进IL-1β或IL-18分泌及细胞焦亡。NLRP3炎症小体参与调控机体抗新孢子虫感染的Th1免疫应答并利于免疫细胞清除新孢子虫。本研究表明NLRP3炎症小体通路可作为治疗或预防新孢子虫病的潜在靶标。