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肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC,简称肝癌)是高发病率和高致死率的恶性肿瘤。目前认为,转移复发是导致肝癌患者不良预后的首要原因。所以,探索肝癌转移复发的机制具有重要的社会意义和研究价值。肝癌的转移复发不仅与肿瘤本身有关,而且与肿瘤微环境(Tumor Microenvironment)密切相关。肿瘤微环境是由肿瘤细胞和多种基质细胞、免疫细胞、细胞因子等组成。肿瘤微环境细胞与肿瘤细胞之间的相互作用(TheCross-Talk)已成为肿瘤转移复发研究的热点。本课题组前期研究发现,肝癌微环境在肝癌的转移复发过程中发挥重要作用(Budhu et al.2006, Cancer Cell)。NR1D1 (nuclear receptor subfamily 1, group D, member 1)是细胞内重要的核受体之一。近期发现NR1D1可以促进肿瘤转移,并且可以通过调节炎症因子的分泌影响机体炎症微环境。题组前期通过基因芯片发现NR1D1与肝癌转移密切相关(Ye QH, et al. Nat Med 2003).本课题将结合临床对NR1D1在肝癌中的表达及其对肝癌细胞行为学影响进行研究,探索NR1 D1在肝癌转移复发中的作用及其相关机制。第一部分NR1D1表达与HCC患者术后生存、复发的关系目的检测NR1D1在正常肝组织、HCC及其癌旁组织标本中的表达水平,并结合临床数据分析其与肝癌术后生存和复发的关系。方法通过RT-PCR、Western-blot和IHC对正常肝组织、HCC癌旁组织和HCC组织进行NR1D1转录和表达水平检测：通过IHC和TMA检测并统计分析239例HCC患者组织中NR1D1表达与肝癌术后生存、复发的关系。结果通过RT-PCT和Western-blot检测发现,与正常肝组织和癌旁肝组织相比,肝细胞肝癌中NR1D1的mRNA转录水平(P<0.05)和蛋白表达水平(P<0.05)明显升高：1HC对正常肝组织、癌旁组织、无血管侵犯肝癌和伴血管侵犯的肝癌组织染色发现,NR1D1在HCC组织中表达明显升高,特别是在伴血管侵犯的肝癌组织中表达量更高：采用IHC对239例HCC病例样本TMA进行检测和评分,分析发现与NR1D1低表达组HCC患者(平均生存时间52.77±1.46月,平均复发时间49.85±1.61月)相比,NRID1高表达患者(平均生存时间44.82±1.598月,平均复发时间41.96±1.85月)术后生存时间短(P=0.0001)、复发率高(P=0.0014)。多因素分析发现NR1D1独立于其他指标,且对原发性肝癌患者术后生存(P=0.01, HR=2.138,95%CI:1.326-3.569)和复发(P=0.007,HR=I.831,95%CI:1.168-2.871)具有良好预测价值。结论1.NR1D1在正常肝组织和癌旁组织中表达低,在肝癌组织中表达高,在伴血管侵犯的肝癌组织中表达最高；2.HCC高表达NR1D1提示肿瘤恶性程度高且患者预后差。第二部分NR1D1对人肝癌细胞增殖和侵袭相关功能的影响目的体内外实验研究NR1D1对人肝癌细胞增殖和侵袭相关功能的影响方法通过Western-blot检测不同转移潜能人肝癌细胞系中NR1D1表达水平；构建高表达NR1D1细胞系BEL7402-NR1D1和干扰NR 1D1表达的细胞系HCCLM3-sh; CCK-8检测各组细胞的增殖情况,克隆形成技术检测细胞的克隆形成能力,利用Transwell小室和人工基质胶进行侵袭实验检测细胞的侵袭能力,通过划痕实验检测细胞的迁移能力；采用肝原位移植瘤技术,建立裸鼠肝原位移植瘤模型,比较成瘤大小和肺转移灶情况。结果Western-blot检测发现HCCLM3细胞NR1 D1蛋白表达水平最高,BEL7402细胞表达较低；高表达NR1 D1或干扰NR1 D1表达肝癌细胞的增殖和克隆形成能力没有变化(P>0.05)：而Transwell侵袭实验和迁移实验发现,NR1 D1促进肝癌细胞的侵袭能力和迁移能力(P<0.05)；裸鼠肝脏原位移植瘤模型发现,干扰NR1D1表达后肿瘤体积小于正常对照组(P<0.05)且无肺转移。结论1.高转移潜能肝癌细胞系HCCLM3的NR1D1表达水平高；2.NR1D1对肿瘤增殖影响的研究发现,体内和体外研究结果相反,NR1D1体外对肿瘤细胞增殖和克隆形成能力无影响,但体内研究发现NR1 D1表达增高可以促进肿瘤生长；3.NR1D1对肿瘤侵袭转移能力影响的研究发现,NR1D1可以促进肿瘤细胞的侵袭、迁移和肺转移能力。第三部分NR1D1通过DUOX2/MCP-1途径募集巨噬细胞促进HCC侵袭转移的机制目的研究NR1D1促进肝癌细胞增殖和侵袭增殖的分子机制方法基因芯片分别检测NR1D1表达差异细胞株间趋化因子家族和基质金属蛋白酶的转录差异,以及表达差异最大的基因,RT-PCR、Western-blot和ELISA检测和验证子DUOX2、CCL-2 (MCP-1)、MMP-2和MMP-9表达量；通过共培养模型,检测NR1D1表达差异的细胞株间对THP-1的趋化影响；通过TAM芯片检测NRID1与癌组织中DUOX2和癌周(癌旁和癌交界处的)CD68表达的相关性：双荧光报告检测NR1D1结合DUOX2启动子的能力；通过共培养模型检测NR1D1表达差异的细胞株上清刺激THP。1后,THP-1对EGF分泌的差异,检测NRID1表达差异细胞间受到THP-1影响后的生长、克隆形成、迁移和侵袭情况：皮下移植瘤和尾静脉肺转移模型验证THP-1对HCC细胞的影响；ROS试剂盒检测细胞内ROS聚集量：Western-blot检测NF-KB(p65)和核内NF-KB(p-p65)的蛋白表达情况并通过免疫荧光共聚焦技术确认；Western-blot检测NRID1表达差异的细胞系间DUOX2、CCL-2、MMP-9和MMP-2的表达。结果基因芯片检测结合RT-PCR、Western-blot和ELISA验证发现,CCL-2(MCP-1), MMP-2和MMP-9表达量随NR1 D1表达增高而显著上调：NRID1表达高的肝癌细胞较NR1 D1表达低的肝癌细胞相比,具有更强的THP-1的趋化能力(P<0.05),且IHC发现,与NR1D1表达低的肿瘤区域,NR1D1表达高的肿瘤周围募集的巨噬细胞(CD68+)数量显著增多,且NRID1高表达与CD68阳性呈正相关(R2=0.31],P<0.01)；用NR1D1表达高的HCC细胞株的上清培养THP-1后,THP-1分泌EGF显著增高(P<0.05); THP-1与NRI D1表达高的HCC细胞共培养后,HCC细胞的生增殖能力、克隆形成能力以及迁移侵袭能力明显增强(P<0.05)；皮下移植瘤和鼠尾静脉肺转移模型发现,人为联合NRID1低表达的HCC细胞与THP-1细胞注射组的肿瘤生长和肺转移能力较单独的NR1D1低表达组显著增强(两者P<0.05)：基因芯片检测发现高表达NR1D1的HCC细胞株可以显著上调DUOX2表达：RT-PCR和Western-blot验证发现,与对照组相比,NR1D1促进DUOX2表达(P<0.05); Western-blot检测发现高转移潜能肝癌细胞DUOX2表达水平显著高于低转移潜能肝癌细胞；双荧光报告发现NR1D1可以增强DUOX2启动子活性；IHC对HCC患者肝癌组织染色发现,NR1 D1和DUOX2表达具有正相关性(R2=0.468,P<0.01)；ROS检测发现,高表达DUOX2可以诱导ROS蓄积量增加(P<0.05); Western-blot和免疫荧光检测发现,NR1D1高表达可以促进NF-kB活化和入核,并促进其下游分子MMP-9、MMP-2和CCL-2的表达。结论NR1D1上调MCP-1的分泌募集单核巨噬细胞,后者与肿瘤细胞发挥相互作用分泌EGF促进肝癌的增殖,而这一过程是通过上调DUOX2的表达促进NF-kB激活的途径实现的。