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研究背景:动脉粥样硬化（atherosclerosis,As）性心血管疾病（cardiovascular disease,CVD）已成为威胁人类健康的主要原因,As作为CVD最主要的病理基础,其发病机制目前尚未完全阐明,亦缺乏能够有效反映As病理改变的血液学标志物。血脂异常是As公认的独立危险因素,其中氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,ox-LDL）起着关键作用。研究显示,ox-LDL可刺激As相关细胞DNA甲基化和微小核糖核酸（micro RNA,mi RNA）的表达发生变化,诱导细胞功能改变,参与As的发生、发展。越来越多证据表明,As可受表观遗传学调控,其中DNA甲基化和mi RNA所引起的基因表达调控作为表观遗传中重要的两大调节过程,二者可相互调节并在As性CVD发生发展过程中发挥重要作用。因此,探寻As性CVD中的DNA甲基化和关键mi RNA及其相互作用机制,可为As新型生物标志物研发及揭示As的病理分子机制提供新思路和理论依据。研究目的:通过研究As性CVD患者特定基因甲基化程度改变、相关mi RNA的水平变化,探究外周血特定基因DNA甲基化相关mi RNA作为As性CVD潜在检测指标的临床价值,进一步通过构建ox-LDL刺激As相关细胞模型,初步揭示二者共同参与As发生发展过程中的潜在分子机制。研究方法:（1）从课题组前期DNA甲基化芯片结果中挑选As性CVD患者甲基化程度显著改变的SMAD3基因,生物信息学方法预测与其共启动子表达的mi RNA（mi R-548h）。收集确诊为As性CVD的患者80例,包括急性冠脉综合征（acute coronary syndrome,ACS）患者42例、稳定性冠心病（stable coronary artery disease,SCAD）患者38例,以及同期在本院健康体检中心进行体检的健康对照者30例。采用全自动生化分析仪检测患者血脂指标和血生化指标;采用甲基化特异性PCR（methylmion specific PCR,MSP）和实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,RT-q PCR）分别检测患者及对照外周血SMAD3基因甲基化水平和外周血mi R-548h水平;利用ROC曲线分析、单因素及多因素Logistic回归分析等多种统计学方法,评估两者单独或联合检测对As性CVD的诊断价值。（2）EA.Hy926人脐静脉内皮细胞融合细胞在体外铺板预培养24 h后,加入终浓度为100μg/m L的ox-LDL,建立不同时间点的内皮细胞损伤模型。运用MSP、RT-q PCR技术分别检测SMAD3启动子区域67356838、67356942两位点的甲基化修饰程度及mi R-548h水平;通过亚硫酸氢盐测序法（bisulfite sequencing PCR,BSP）进一步确认SMAD3的甲基化程度;在EA细胞中瞬时转染mi R-548h mimics和mi R-548h inhibitor,q RT-PCR检测转染效果;蛋白免疫印迹（Western blot,WB）检测mi R-548h预测靶基因蛋白的表达水平。结果:（1）与健康对照相比,ACS及SCAD患者外周血SMAD3基因启动子区域67356838（位点1）、67356942（位点2）两位点的甲基化程度及平均甲基化程度均显著降低,而外周血mi R-548h水平显著升高（P均<0.05）;相关性分析显示,循环mi R-548h水平与SMAD3位点1、2甲基化程度及平均甲基化程度均显著负相关（P均<0.05）;SMAD3甲基化改变对于ACS及SCAD患者诊断的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.856和0.680,mi R-548h水平改变对于ACS及SCAD患者诊断的AUC分别为0.994和0.918,二者联合诊断的AUC分别为0.996和0.970。采用配对设计两种诊断试验AUC差别假设检验进行比较结果显示:联合SMAD3/mi R-548h Panel判别全部CVD的AUC效能显著高于单独检测SMAD3甲基化（Z=4.293,P<0.001）或mi R-548h水平的AUC（Z=2.158,P<0.05）;联合SMAD3/mi R-548h Panel分别判别SCAD（Z=3.645,P<0.001）和ACS（Z=2.947,P<0.05）患者的AUC效能显著高于单独检测SMAD3甲基化的AUC效能。（2）经ox-LDL处理的EA细胞损伤模型中,SMAD3甲基化程度显著下降,mi R-548h水平显著升高;生物信息学分析预测发现血管生成素2（angiopoietin 2,ANGPT2）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ）是mi R-548h的潜在靶基因;Western blot结果显示,在体外人为过表达或抑制mi R-548h水平,可明显影响ANGPT2、PPARγ蛋白表达水平。结论:As性CVD患者外周血SMAD3甲基化水平显著降低,而其共启动子表达的mi R-548h水平显著升高,是As性CVD患者潜在的诊断指标,两者联合检测有望成为一种新的As性CVD诊断新指标和新方法;SMAD3甲基化水平降低与mi R-548h表达上调具有一定相关性,后者可能调控ANGPT2、PPARγ蛋白表达参与As相关内皮细胞损伤,与As性CVD发生发展密切相关。