三磷酸核糖核苷酸(ATP、GTP、CTP、UTP)和三磷酸脱氧核糖核苷酸(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)是一类极性较大的物质,它们是合成RNA和DNA的原料,参与了细胞内的能量传递过程以及多种物质的合成和代谢反应,是细胞中一类重要的化合物。研究这类物质的变化过程,对于了解细胞的能量代谢水平,认识细胞的周期调节,病毒感染及药物作用机制有较为重要的作用。由于极性较大,这类化合物使用常规的反相色谱法无法进行分离,主要使用离子对色谱法进行测定。以往应用离子对色谱法对这类物质进行的相关研究中,液相色谱条件并未达到最优,使得有些成分的分离不甚理想,不能满足准确含量测定的需要。因此,本实验在前人实验的基础上进行了全面系统的优化,建立了一套稳定可靠的液相分离方法,为该类物质的代谢变化研究奠定基础;同时,应用毛细管区带电泳和亲水色谱法,对该类物质的分离分析进行了初步探索;最后,应用代谢组学的理念,对于普通肝癌细胞和给药后肝癌细胞中三磷酸核糖核苷酸的代谢变化进行了初步研究。本文从人肝癌细胞HepG2的基本培养入手,对于细胞培养过程中所需要的传代、冻存、复苏等基础而必需的实验环节进行了摸索和完善;绘制了该细胞系的生长曲线,并观察了处于对数生长期细胞的形态;研究了三种作用机制完全不同的临床常用药物(5-氟尿嘧啶、硫酸长春新碱、丝裂霉素C)对其的抑制情况,包括抑制曲线和半数抑制浓度(IC50)。通过比较,从抑制效果、用药剂量和药物稳定性综合评价,确定在药物筛选实验中,硫酸长春新碱是最适宜作为阳性药物的。以氢氧化四丁基铵盐作为离子对试剂,应用离子对反相高效液相色谱技术对该细胞中的三磷酸核糖核苷酸和三磷酸脱氧核糖核苷酸的分离进行了系统深入的研究,分别考查了流动相中有机相的种类、浓度和pH值,以及检测器的检测波长、流速和柱温,最终确定的分离条件为:流动相A:10mM氢氧化四丁基铵、10mM KH2PO4,以H3PO4调节pH=7;流动相B:5.6mM氢氧化四丁基铵、50mM KH2PO4、30%甲醇,以NaOH调节pH=7。梯度洗脱程序如下:0-50min,60%B-90%B;50-75min,90%B。流速:0.4 mL/min,检测波长:260nm;进样量:50μL,柱温:20℃。经方法学验证,本方法的色谱分离选择性好,各待测物在各自的浓度范围内线性良好r>0.9994,加样回收率94%~106%,日内精密度RSD<3%,日间精密度RSD<6%,12小时稳定性RSD<4%,均符合要求。毛细管区带电泳和亲水色谱串联质谱法的分离机理与离子对高效液相色谱法完全不同。它们对于结构相似且极性较大物质的分离分析是非常有效的。建立了毛细管区带电泳对于这类物质的分离方法。分别对电泳的缓冲液种类和浓度、pH值、运行温度、运行电压、有机改性剂、毛细管柱长度、毛细管柱内径进行了考查,最终优化出下列条件:运行缓冲液为40mM硼酸钠,pH=9.45,毛细管长度49.0cm×50μm(有效长度40.5cm),正极进样,负极检测,两次进样之间用1M NaOH、缓冲溶液各冲洗5min。压力进样50mbar×3s,分离电压为18 kV,分离温度为15℃,紫外检测波长为260nm。本方法可以实现待测物混合对照品的良好分离。建立了亲水色谱串联质谱法对于这类物质的测定方法。以氨基柱作为亲水色谱柱,应用亲水色谱法串联质谱,并采取选择离子监测的模式,分别优化了流动相的缓冲盐种类、浓度和pH值,以及质谱检测器的检测模式、提取离子质荷比等条件,具体条件如下:92%20mM乙酸铵(pH=9.5)+8%乙腈,等度洗脱65分钟,柱温:25℃;流速:1 mL/min;检测波长:260nm;分流比:4:1;进样量:10μL。本方法可以实现对待测物的分离。结合代谢组学的理念,这三种作用机制完全不同的临床常用药物——5-氟尿嘧啶、硫酸长春新碱和丝裂霉素C作为外界扰动,给予细胞刺激,提取胞内物质,研究并比较经不同药物作用后细胞内三磷酸核糖核苷酸的代谢特点,将这些物质的变化与其合成和代谢途径,以及药物的作用机制联系并加以验证。经3种药物作用后,ATP含量均下降,提示与ATP代谢有关,对其进行含量测定,可作为三磷酸腺苷生物发光法的佐证,应用于抗肿瘤药物筛选实验中。经长硫酸长春新碱作用后,GTP和ATP含量下降,其中GTP的变化提示与硫酸长春新碱对于微管的作用有关。经丝裂霉素C后,GTP和ATP含量下降,提示与丝裂霉素C与嘌呤类核苷酸的交联有关。经5-氟尿嘧啶作用后,CTP、GTP、ATP均下降,原因有待进一步考查。虽然本研究并未对4种三磷酸核糖核苷在药物作用后的变化机理全部进行解释,但是所得结论足以说明体内生理生化过程与核苷酸的代谢变化密切相关。