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鸡球虫病(Coccidiosis)是由艾美属(Eimeria)的多种球虫寄生于鸡消化道引起的一种严重危害养鸡业发展的原虫病,全世界每年因鸡球虫病而造成的经济损失高达20亿美元以上。我国是养鸡大国,占世界总养鸡量的10 %,每年由鸡球虫病造成的直接和间接经济损失难以估计。目前球虫病主要依靠药物防治,但由于球虫耐药性的不断增强以及药物残留肉蛋危害人体健康,使得药物防治鸡球虫病举步维艰,也迫使人们将目光转向免疫预防等替代控制方法。本研究对巨型艾美球虫南通株(E.maxima,NT株)配子体抗原gam56基因进行了克隆、序列分析和原核表达,以及gam56抗原对E.maxima的免疫保护作用,为在临床上利用亚单位疫苗控制鸡球虫病奠定基础。一、巨型艾美球虫配子体gam 56基因的克隆和序列分析以E.maxima NT株纯化的配子体提取的总RNA为模板,设计特异性引物,应用两步法RT-PCR技术扩增出gam56基因的特异性片段。将扩增片段插入pGEM-T载体,随机选择经蓝白斑筛选、PCR及酶切鉴定为阳性的2个克隆分别进行测序分析,并对结果进行验证。结果显示,2个阳性克隆所含插入片段的DNA序列完全一致,含一全长1 431个核苷酸的开放阅读框。其序列与E.maxima Houghton株的开放阅读框一致。二、巨型艾美球虫配子体gam 56基因在大肠杆菌中的融合表达根据E.maxima NT株gam56抗原基因的cDNA序列设计2对引物,经PCR从阳性质粒模板中扩增出gam56基因不含信号肽的编码区片段。将该基因片段酶切回收后按正确的阅读框架克隆入大肠杆菌表达载体pGEX-6P-1谷光甘肽-S-转移酶基因的下游,构建重组表达质粒pGEX-6P-1-gam56-1和pGEX-6P-1-gam56-2,并经测序验证。重组菌经过IPTG诱导后,通过SDS-PAGE电泳,gam56基因的2个片段在大肠杆菌中得到了融合表达,融合蛋白分子量分别约为44 Ku和38 Ku。可溶性分析表明,pGEX-6P-1-gam56-1融合蛋白主要以包涵体形式存在,而pGEX-6P-1-gam56-2融合蛋白则主要以可溶性形式存在。三、巨型艾美球虫重组抗原gam56-2的免疫保护效果试验以E.maxima配子体抗原的基因工程重组菌pGEX-6p-1-gam56-2/BL21诱导表达产物—重组gam56-2蛋白为抗原,加或不加弗氏完全佐剂,制备免疫原。分别设3个剂量组,经皮下注射,于5日龄、12日龄和19日龄对雏鸡进行3次免疫,同时设立未免疫未攻毒组和未免疫攻毒组作对照。在26日龄时用5×104个E.maxima南通株孢子化卵囊进行攻毒,8 d后扑杀,对各组的存活率、相对增重率、病变记分减少率、卵囊减少率和抗球虫指数(ACI)等指标进行统计分析,比较免疫保护效果。结果显示,就相对增重率而言各免疫组较未免疫攻毒组的要高27个百分点以上,均有一定的保护作用;但就病变记分减少率与卵囊减少率指标而言,各免疫组均小于70 %与75 %,判为无保护力;而从抗球虫指数水平来看,重组蛋白中剂量佐剂组、重组蛋白低剂量佐剂组与重组蛋白中剂量组的抗球虫指数均在160～180之间,为抗球虫中效范围,其余各免疫攻毒组的抗球虫指数均小于160,为低效水平;在各免疫攻毒组试验组间相比而言,重组蛋白中剂量佐剂组、重组蛋白低剂量佐剂组与重组蛋白中剂量组的保护力较其它剂量组的要好。