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香椿叶味苦、性温,具有清热收敛、消炎解毒、去燥湿等功效,临床主治肠炎、痢疾等疾病;此外,香椿叶已有两千多年的食用历史,是蔬菜中不可多得的珍品,深受广大消费者的青睐,在国外被称为“绿色保健菜”。现代研究表明,香椿叶提取物具有抗氧化、抗肿瘤、降血脂等多种生物活性;国内外学者对香椿叶中的化学成分开展了一些研究,发现其所含化合物的种类丰富,主要包括黄酮类和没食子酸类,是值得进一步研究、开发前景良好的药食两用中药。本文研究了香椿叶黄酮类化合物的提取、分离与鉴定,含量测定及蛋白质的初步分析。主要研究内容及结论如下:(1)香椿叶中黄酮类化合物的提取、分离与鉴定利用硅胶柱层析与制备HPLC等研究了香椿叶提取物乙酸乙酯萃取部位的化学成分,共计得到11个单体化合物,通过MS和NMR等波谱方法对其进行结构鉴定,分别为1,2,3,4,6-五没食子酸-β-D-葡萄糖苷(Ⅰ)、没食子酸(Ⅱ)、没食子酸乙脂(Ⅲ)、芦丁(Ⅳ)、杨梅苷(Ⅴ)、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷(Ⅵ)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅶ)、槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖苷(Ⅷ)、紫云英苷(Ⅸ)、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷(Ⅹ)和山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(Ⅺ)。(2)香椿叶中黄酮类化合物的含量测定首先选择了香椿叶中含量最高的黄酮苷(槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷)进行含量检测,通过对流动相组成、色谱柱、提取时间、提取溶剂等影响因素的优选,建立了一套简便易行、稳定准确、分离效果好的分析方法。即色谱柱为XBridge Shield RP18(4.6 mm×150 mm,5μm),流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B);等度洗脱程序为0~30 min,A为20%,B为80%;流速为1.0 mL/min;检测波长为254 nm;柱温为40oC;进样量为20μL。在该条件下,该化合物在5.260~105.2μg范围内呈现良好的线性关系,相关系数r2为0.9991,其精密度(n=6)处于0.90%~1.95%,该方法重复性良好(RSD<2%,n=6),且样品溶液在48 hrs内稳定;该方法的平均加样回收率为95%~110%(n=3),RSD均小于5%;测定6个产地含量分别为0.271%(河南西平,a)、0.826%(山西运城,d)、0.808%(山东西牟,f)、0.459%(河南焦作,l)、0.222%(四川简阳,m)和0.293%(江苏镇江,g)。由此可见,不同产地香椿叶中该黄酮苷的含量存在一定差别,其中山西运城产香椿叶含量最高,四川简阳最低。此后,对从香椿叶中分离得到的8种黄酮苷,即芦丁(Ⅳ)、杨梅苷(Ⅴ)、山奈酚-3-o-β-d-半乳糖苷(Ⅵ)、槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖苷(Ⅶ)、槲皮素-3-o-α-l-阿拉伯糖苷(Ⅷ)、紫云英苷(Ⅸ)、槲皮素-3-o-α-l-鼠李糖苷(Ⅹ)和山奈酚-3-o-α-l-鼠李糖苷(Ⅺ),进行含量测定,通过对流动相组成、柱温、流速等影响因素的优选,利用正交设计对提取条件选择进行优化,最终建立了一套简便易行、稳定准确、分离效果好的提取与分析方法,即提取条件为料液比为1:40、60%甲醇、超声提取30mins;色谱柱为watersrp18(2.1mm×150mm,1.7μm);流动相为0.05%三氟乙酸水溶液(a)-0.05%三氟乙酸乙腈溶液(b);梯度洗脱程序为0~10min,a由88%降至70%,10~17min,维持70%;流速为0.350ml/min,检测波长为350nm,柱温为30oc,进样量为5μl;在该条件下,Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ和Ⅺ分别在0.906~58.0、0.0813~5.20、0.0813~5.20、1.05~67.40、0.113~7.20、0.263~16.8、2.47~158、1.45~92.6μg范围内呈现良好的线性关系,相关系数r2分别为1.0000、1.0000、0.9999、1.0000、0.9992、0.9992、1.0000和1.0000;精密度(n=6)处于0.10%~3.28%,该方法重复性良好(rsd<5%,n=6),且样品溶液在48hrs内稳定;该方法的平均加样回收率为95%~110%(n=3),rsd均小于5%。测定了10个不同产地(河南西平,a;四川绵阳,b;山东烟台,c;山西运城,d;河南周口,e;山东西牟,f;江苏镇江,g;江苏丹阳,h;河南温县,j;山东郓城,k)采收的香椿叶中8种黄酮苷的含量,其中化合物Ⅳ的含量为0.023%~0.16%;化合物Ⅴ的含量为0.003%~0.18%;化合物Ⅵ的含量为0.018%~0.111%;化合物Ⅶ的含量为0.071%~0.358%;化合物Ⅷ的含量为0.007%~0.067%;化合物Ⅸ的含量为0.011%~0.104%;化合物Ⅹ的含量为0.415%~1.270%;化合物Ⅺ的含量为0.59%~0.795%。此外,测定了10个月份(2013.03~2013.11)香椿叶中8种黄酮苷的含量,其中化合物Ⅳ的含量为0.047%~0.131%;化合物Ⅴ的含量为0.002%~0.016%;化合物Ⅵ的含量为0.015%~0.060%;化合物Ⅶ的含量为0.081%~0.305%;化合物Ⅷ的含量为0.007%~0.337%;化合物Ⅸ的含量为0.024%~0.932%;化合物Ⅹ的含量为0.069%~0.747%;化合物Ⅺ的含量为0.146%~0.746%。由此可见,不同产地与不同月份的香椿叶中8种黄酮苷的含量存在一定差别,发现山东烟台香椿叶有5个黄酮苷(分别为芦丁、杨梅苷、槲皮素-3-o-β-d-半乳糖苷、槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖苷、山奈酚-3-o-α-l-鼠李糖苷)的含量位于最高,总黄酮含量也最高;山东郓城香椿叶有3个黄酮苷(分别为槲皮素-3-o-β-d-半乳糖苷、槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖苷、山奈酚-3-o-α-l-鼠李糖苷)含量处于最低,总黄酮含量也最低。4月采收的香椿叶中有4个黄酮苷(分别为芦丁、槲皮素-3-o-β-d-半乳糖苷、槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖苷、槲皮素-3-o-α-l-阿拉伯糖苷)含量处于最高,6月有2个黄酮苷(分别为紫云英苷、槲皮素-3-o-α-l-鼠李糖苷)含量处于最高;而7月采收的香椿叶中有6个黄酮苷(分别为芦丁、杨梅苷、槲皮素-3-o-β-d-半乳糖苷、槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖苷、槲皮素-3-o-α-l-阿拉伯糖苷、槲皮素-3-o-α-l-鼠李糖苷)含量处于最低,8月有2个黄酮苷(分别为紫云英苷、山奈酚-3-o-α-l-鼠李糖苷)含量处于最低。(3)香椿叶中蛋白质的初步分析通过对不同月份采收的香椿叶样品进行sds-page分析,发现香椿叶中蛋白质的分子量主要集中在35kd以下,不同月份采收的香椿叶的蛋白质有一定的差别。此后,对其中的6个主要条带进行切割、消化,并使用maldi-tof-ms测定多肽片段的m/z,结果显示条带1主要集中在2200~2450da;条带2集中在2100~4980da;条带3主要集中在2400~4200da;条带4集中在2100~2550da;条带5、6集中在2100~4980da。对maldi-tof-ms测定结果使用mascot数据库进行搜索,结果显示6个主要蛋白质条带可能为hypotheticalprotein[lactobacilluskisonensis]、phosphodiesterase[pseudomonassp.gm55]、dihydroxy-aciddehydratase[micrococcusluteus]、hypotheticalprotein[crocinitomixcatalasitica]、uncharacterizedproteinloc106503571[caprahircus]、abctransportersubstrate-bindingprotein[pseudoalteromonascitrea]。