论文部分内容阅读
酒精性肝脏疾病(alcoholic liver disease,ALD)是指由于长期的、不当的酒精摄取所造成的肝脏损伤,最终导致的一系列肝脏疾病。酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease,AFLD)是酒精性肝病的初期阶段,90%以上的酗酒者都呈现出肝脏脂肪变性的特征。由于AFLD没有明显的临床症状,并且通过酒精戒断是可以缓解和逆转的,因此人们对其重视程度不高;然而越来越多的研究发现,20%~40%的AFLD患者会发展为肝纤维化;这其中有8%~20%的患者还会进一步发展为肝硬化;3%~10%的肝硬化患者最终会恶化为肝癌。同时有研究表明,不当的酒精摄入所引起的脂质代谢异常可能与肿瘤的发生与发展有着密切联系,异常的脂质代谢会为肿瘤的发生提供有利环境。CYP450酶是一种以铁卟啉为辅基的蛋白质,是肝脏中参与药物生物转化的最重要的Ⅰ相代谢酶,介导多种临床药物、环境物质以及内源性物质在体内的氧化、还原及水解,其中包含一些具有肝脏毒性的药物。CYP450酶的活性变化会对药物的疗效以及毒性产生一定的影响,可能导致严重的不良反应。迄今为止的研究当中,对于酒精肝疾病状态下CYP450酶的变化研究较少,仅有个别亚型酶(如CYP2E1)的变化及功能被报道。了解酒精性脂肪肝状态下肝脏中几种主要的CYP450亚型酶的表达及活性变化情况;以及在酒精所诱发的脂质代谢异常过程中CYP450酶的作用及其机制对于探讨ALD的病理机制及其治疗与预防提供实验依据。本课题的研究主要分为以下三个部分进行:1.酒精性脂肪肝模型大鼠中主要CYP450亚型酶的表达与活性变化将SD大鼠随机分为正常对照组、蔗糖对照组和模型组进行实验。模型组大鼠每周给予含不同浓度酒精与18%蔗糖混合的饮水,第一周饮水的酒精含量为5%,之后以每周增加5%的幅度递增至第八周的40%,一直维持该浓度至第12周;蔗糖对照组给予含18%蔗糖的饮水,持续12周;正常对照组正常饮水12周。分别采用Q-PCR、Western-blot和肝微粒体温孵体系中特异性代谢产物生成量检测CYP1A2,CYP2B6,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6,CYP2E1,CYP3A4七种主要代谢酶在mRNA、蛋白水平的表达以及活性变化情况。实验结果表明,酒精肝模型组中的CYP1A2、CYP2D6和CYP3A4的mRNA表达、蛋白表达以及酶活性均高于正常对照组和蔗糖对照组;模型组中CYP2B6和CYP2C9的mRNA表达、蛋白表达以及酶活性显著低于正常对照组和蔗糖对照组;CYP2C19在各组中的mRNA表达、蛋白表达和酶活性均无明显变化。说明酒精对肝脏中的各种亚型酶具有不同的调控作用,特别是其中与常用临床药物代谢以及药物性肝损伤密切相关的亚型酶,如CYP1A2、CYP3A4等亚型酶的变化值得引起关注。2.CYP1A2在酒精诱导的肝脏脂质代谢异常中的作用研究使用不同浓度(0、50、100、200、400、800 mM)的酒精刺激L02细胞12、24、48 h,MTT法选择合适的酒精刺激浓度和时间;采用Q-PCR和Western blot技术分别检测L02细胞中的CYP1A2在mRNA和蛋白水平的表达。实验结果显示,100 mM的酒精刺激L02细胞后CYP1A2的mRNA和蛋白表达均显著增加,炎症因子NF-κB和TNF-α的蛋白表达也显著增加。为了研究CYP1A2在酒精性肝损伤所导致的脂质代谢异常中所发挥的作用,在酒精刺激细胞之前分别进行CYP1A2基因沉默和马来酸氟伏沙明(CYP1A2特异性抑制剂)预处理,培养结束后,测定培养基上清以及细胞匀浆中的各项生化指标,在沉默了CYP1A2或使用抑制剂的情况下,酒精刺激所引起的肝脏损伤有一定程度的减弱,沉默组和抑制剂组酒精刺激后的ALT和TG值相比正常对照组显著降低;Western-blot方法检测各组细胞中的SREBP-1c,PTEN,AKT和p-AKT的蛋白表达,结果显示,CYP1A2的表达被抑制时,在沉默组和抑制剂组中,SREBP-1c相对正常对照组酒精刺激后在细胞中的表达降低;正常对照组在酒精刺激后,细胞中PTEN的表达减少,而CYP1A2的表达降低使得转染细胞中PTEN的表达进一步减少,提示CYP1A2的抑制会下调SREBP-1c的表达,从而对脂质代谢产生影响,并有可能通过对PTEN的调控影响SREBP-1c的表达。3.CYP1A2在酒精诱导的肝脏脂质代谢异常中的部分调控机制为了研究CYP1A2在酒精性肝损伤中对脂质代谢的调控作用机制,探究这一过程中CYP1A2、PTEN及SREBP-1c之间的关系,我们使用pcDNA3.1-PTEN过表达质粒转染L02细胞,转染完成后,再用酒精持续刺激细胞24 h,Western-blot方法检测各组细胞中的PTEN,p-AKT,AKT和SREBP-1c的蛋白表达。PTEN过表达时,p-AKT和SREBP-1c的表达降低,差异具有统计学意义;给予酒精刺激后,正常组和转染组的PTEN的表达降低,而p-AKT和SREBP-1c的表达均显著增加,说明PTEN对SREBP-1c可能具有一定的调控作用;为了进一步确认PTEN对AKT、p-AKT和SREBP-1c的表达的影响,使用siRNA-PTEN及PTEN的特异性抑制剂bpv处理L02细胞,之后再用酒精刺激细胞24 h,Western-blot方法检测各组细胞中的PTEN,p-AKT,AKT和SREBP-1c的蛋白表达,当PTEN沉默或被抑制时,p-AKT和SREBP-1c的表达显著增加,差异具有统计学意义;给予酒精刺激后,正常组和转染组或抑制剂组的PTEN的表达降低,而p-AKT和SREBP-1c的表达均显著增加,说明在酒精刺激诱导的肝脏脂质代谢异常中PTEN/AKT通路对SREBP-1c具有一定的调控作用。