【摘 要】
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目的:本研究目的在于探索组织缓激肽蛋白KLK11参与压力过载心肌肥厚的通路调节途径及激活方式,揭示KLK11在心肌细胞肥大中对AKT-m TOR信号通路及下游蛋白起到的调节作用,期待能在分子水平上明确心肌肥厚发展过程中缓激肽酶KLK11的作用机制,为预防和治疗心肌肥厚提供新的思路和方法。方法:1.利用动物模型（主动脉缩窄制备小鼠心肌肥厚,通过超声心动图验证）和临床人体捐献心脏器官样本,采用实时荧光
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目的:本研究目的在于探索组织缓激肽蛋白KLK11参与压力过载心肌肥厚的通路调节途径及激活方式,揭示KLK11在心肌细胞肥大中对AKT-m TOR信号通路及下游蛋白起到的调节作用,期待能在分子水平上明确心肌肥厚发展过程中缓激肽酶KLK11的作用机制,为预防和治疗心肌肥厚提供新的思路和方法。方法:1.利用动物模型（主动脉缩窄制备小鼠心肌肥厚,通过超声心动图验证）和临床人体捐献心脏器官样本,采用实时荧光定量PCR（q RTPCR）和蛋白免疫印迹（Western blot,WB）检测人和小鼠肥厚心脏组织中KLK11的表达,根据实验动物及临床病例数据分析KLK11与心肌肥厚的相关性;2.体外实验:借助细胞模型,采用血管紧张素II（Ang II）体外诱导心肌细胞肥大,通过上调（用腺相关病毒AAV9介导过表达）或沉默（si RNA敲低）KLK11,系统研究KLK11在心肌细胞肥大中的作用:通过细胞染色对比KLK11表达升高或降低后心肌细胞大小及q RT-PCR检测心肌肥厚标志物心房利钠肽（ANP）、脑利钠肽（BNP）和β-肌球蛋白重链（MYH7）的m RNA的变化;3.体内实验:用腺相关病毒AAV9介导sh KLK11低表达,C57BL/6小鼠通过尾静脉注射生理盐水或AAV9载体,8周后,接受TAC或假手术,验证敲除率满意后,超声心动图分别检测4组小鼠心脏功能短轴缩短率（Fractional shortening,FS）及射血分数（Ejection fraction,EF）,随后计算心脏重量/体重（HW/BW）,胫骨长度/胫骨长度/（HW/TL）以此来评估心肌肥厚,再行心肌组织染色观察心肌细胞大小以及心肌肥厚标志物的表达量差异,评估在体敲低KLK11是否对TAC诱导的心肌肥厚产生作用;4.同样实验条件下使得KLK11过表达及敲低后,采用WB实验方法检测S6K1、4EBP1的磷酸化及蛋白合成（3H-亮氨酸掺入法分析）的改变,分析KLK11与蛋白合成之间的关系;5.体外细胞实验,采用雷帕霉素抑制AKT-m TOR通路,用腺病毒感染小鼠心肌细胞24小时,然后在雷帕霉素（100n M）的培养条件下再加入Ang II（1μM）处理24小时,用WB验证KLK11对Akt、m TOR、S6K1、4EBP磷酸化、蛋白的合成,Image J检测心肌细胞大小以及q RT-PCR检测肥大心肌标志物的表达量影响是否会被阻断。结果:1.在小鼠心肌肥厚模型和临床心肌肥厚患者的心肌组织中,ANP、BNP和MYH7呈过表达（P＜0.001）,KLK11的m RNA水平和蛋白表达量较正常心肌组也均显著上调（P＜0.001）;2.体外实验中,敲低KLK11降低了Ang II诱导的心肌细胞肥厚性生长,肥厚标志基因的过表达（P＜0.001）,相反,过表达KLK11促进Ang II诱导的心肌细胞肥厚性生长,以及心肌细胞肥厚标志物基因的过表达（P＜0.001）;3.体内实验中,敲低KLK11逆转了TAC诱导的小鼠心功能及心肌肥厚:超声心动图提示AAV9-sh KLK11+TAC组小鼠较AAV9-sh Ctrl+TAC组小鼠心肌FS值和EF值下降较对照组明显改善,且TAC诱导的小鼠心脏重量比HW/BW、HW/TL降低,病理切片染色显示心肌细胞大小,ANP、BNP和MYH7表达也显著增加（P＜0.001）;4.细胞实验证实,敲低KLK11可抑制Ang II诱导的心肌细胞蛋白合成,抑制S6K1和4EBP1的磷酸化（P＜0.001）,反之,过表达KLK11可促进Ang II诱导的心肌细胞蛋白合成,促进S6K1和4EBP1的磷酸化（P＜0.001）;5.体内外实验均提示KLK11的下调抑制了Akt-m TOR的磷酸化,体外实验提示过表达KLK11促进Akt-m TOR的磷酸化,加入雷帕霉素后抑制了KLK11介导的S6K1和4EBP1磷酸化、心肌细胞的肥大以及肥厚标志基因的表达（P＜0.001）。结论:1.KLK11是心肌肥厚的调节因子,促进心肌细胞肥大,降低心功能;2.KLK11的促心肌细胞肥大作用是通过激活AKT-m TOR信号通路完成的,即KLK11调节m TOR信号以靶向心肌肥厚;3.AKT-m TOR信号通路激活后,进一步促进S6K1和4EBP1的蛋白合成;4.S6K1和4EBP1可能是KLK11促进心肌肥厚的下游靶点。
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