目的:协同作用是中药活性成分发挥药效作用的重要方式,本文通过多室电泳分离/质谱技术体系探寻中药黄芩中与功能蛋白FGF2能够协同作用的成分;并将其与FGF2联合应用,考察成分蛋白复合体对成纤维细胞(NIH3T3)的细胞增殖、胶原合成及细胞迁移的影响;以及对皮肤损伤动物模型创面愈合的活性作用。方法:1.建立多室电泳方法,考察缓冲液、缓冲液pH、电压、电泳时间等用于FGF2的多室电泳分离系统的参数。2.FGF2与黄芩提取液在多室电泳分离系统中进行孵化,通过蛋白电泳筛选协同成分。3.建立LC-MS/MS方法检测黄芩提取液有效成分,并定性出与FGF2有协同效应的成分。4构建适用于黄芩苷、汉黄芩苷、千层纸素A-7-0-β-D葡萄糖醛酸苷三种成分的LC-MS/MS MRM检测方法,定量分析与FGF2有协同效应的三个成分并计算结合摩尔比。5.将NIH3T3细胞分为空白对照组、单标给药组、蛋白给药组,采用噻唑蓝(MTT)法检测每组细胞增殖情况,确定最佳给药浓度范围。6.将NIH3T3细胞分为空白对照组、单一成分给药组、FGF2给药组、三个成分联合给药组、FGF2和单一成分给药组以及FGF2和三个成分联合给药组;依据计算的成分摩尔比以及检测的最佳给药浓度范围分别对各组给药48 h;采用MTT法检测每组细胞增殖情况。7.将NIH3T3细胞分为空白对照组、FGF2给药组、三个成分联合给药组以及FGF2和三个成分联合给药组给药48 h,采用小鼠羟脯胺酸试剂盒检测给药后每组胶原蛋白含量。8.将六孔板上的NIH3T3细胞分为空白对照组、FGF2给药组、三个成分联合给药组以及FGF2和三个成分联合给药组,对六孔板内的细胞划痕造模后给药24h,在第0 h、6、12、24h拍照测量划痕宽度检测细胞的迁移情况。9.选取SPF级BALB/c雄性小鼠72只,在背部两侧分别手术致0.6 cm2圆形全层皮肤组织缺失,建立皮肤伤口模型;随机分为空白对照组、FGF2给药组、FGF2与三个成分联合给药组、三个成分联合给药组;每日生理盐水清理伤口后给药,拍照测量计算伤口面积;第4、7、14d,每组创面组织取样,石蜡包埋、切片,组织病理切片HE染色、Masson染色;免疫组化检测IL-6、VEGF、CD31。结果:1.多室电泳分离系统参数为,缓冲溶液为10 mM乙酸铵、施加电压为14V、时间为15 min、pH6.8时、孵化温度37℃、靶蛋白向负接收室迁移率37.8%(RSD=3.14%)。2.多室电泳分离系统筛选出黄芩提取液中3种与FGF2具有潜在协同作用的成分,定性检测为黄芩苷、汉黄芩苷、千层纸素A-7-0-β-D葡萄糖醛酸苷;其协同摩尔比例为3:1:1,与FGF2均是以氢键结合。3.FGF2在50 ng/mL时,细胞增殖作用最佳,增殖率为162.25%(RSD=3.4%),随着浓度的升高,有抑制细胞增殖的作用;FGF2与三种潜在协同成分联合给药能促进细胞增殖,增殖率为212.79%(RSD=8.22%),增加胶原蛋白浓度,增殖率为123.1%(RSD=5.49%),与FGF2单独给药均具有显著差异(P<0.05);还能提升细胞的迁移能力。4.FGF2与三个成分协同用药促创面愈合效果最佳,其炎细胞浸润程度显著降低,胶原蛋白、成纤维细胞排列整齐、致密,新生血管密度较模型组显著增加。5.FGF2与三个成分在创面协同用药,可以下调IL-6表达,抑制创面炎性因子的释放,减轻炎症反应;上调VEGF表达,促进血管生成,加速创面愈合;上调CD31表达,促进内皮细胞、血管新生和肌纤维增生。结论:基于多室电泳分离系统串联LC-MS/MS从黄芩提取液中筛选出3种与FGF2具有协同促进创面愈合的活性成分,分别为黄芩苷、汉黄芩苷、千层纸素A-7-0-β-D葡萄糖醛酸苷,其协同摩尔比例为3:1:1;FGF2与三种协同成分联合给药能促进成纤维细胞增殖,增加胶原蛋白浓度,加快细胞迁移;FGF2与三种协同成分联合给药能促进BALB/C小鼠的创面愈合。