原发性肝癌（Primary Hepatic Carcinoma,PHC）是世界最常见且恶性程度最高的肿瘤之一,发病率在恶性肿瘤中位居世界第5位,死亡率位居第3位。我国由于大量慢性乙型肝炎感染人群的存在,目前原发性肝癌仍是我国高发的重大疾病,其发生率约为30.3/10万,每年约有14万人死于PHC,占全世界PHC死亡人数的50%以上。肝癌由于起病隐匿、进展迅速,临床治疗效果仍然较差。目前,肝癌的临床诊断并不困难,但临床发现的大多数病例属于中晚期。针对肝癌的各种治疗手段包括外科治疗、肝动脉/门静脉化疗栓塞术、消融治疗及放射治疗等均有一定的效果,利用各种治疗手段对肝癌患者进行综合治疗是目前肝癌治疗的趋势。20世纪后期人们开始用系统生物学观点来研究肿瘤,认识到肿瘤是一种多因素参与、多步骤发展的全身性、系统性疾病。引发癌基因突变、抑癌基因缺失或基因表达调控失常引起肿瘤基因组稳定性丧失,进而导致肿瘤细胞出现异常的生物学行为。分子靶向治疗指使用小分子化合物、单克隆抗体、多肽等物质特异性干预调节肿瘤细胞生物学行为的信号通路,从而抑制肿瘤发展。分子靶向治疗在本质上有别于传统的化学治疗,分子靶向治疗针对肿瘤异常的信号通路,具有高选择性、低毒性和高治疗指数,可以长期用药。细胞分裂时,染色单体在纺锤体上的运动依赖于微管的动力不稳定性,微管调节蛋白表达的紊乱可以破坏有丝分裂、中止恶性细胞的生长。Stathmin是一种新发现的微管不稳定蛋白,在细胞周期的不同阶段通过磷酸化和去磷酸化作用对细胞微管系统动力平衡的调节发挥十分重要的作用。多种恶性肿瘤中stathmin都有高水平表达,通过抑制其表达可以干扰恶性细胞的分裂。研究表明,stathmin提供了一个肿瘤基因治疗的分子新靶点。Stathmin是从淋巴瘤中筛选出的特征性基因的表达产物,由149个氨基酸组成,分子量约19kD,在脊椎动物细胞中普遍存在、高度保守的胞质磷蛋白。信号转导研究显示:细胞内、外有多种细胞因子、癌基因及抑癌基因表达产物直接或间接与stathmin作用引起细胞生物学改变。Stathmin是多种细胞内激酶的作用底物,其下游作用靶点则是在细胞分裂周期中起关键作用的微管蛋白、微管及纺锤体等细胞器。通过调节微管系统的动力学平衡,stathmin可以控制细胞周期,并以此改变细胞的增殖、分化、活性等生物学行为。Stathmin促微管解聚的活性受其自身磷酸化水平的调节,相对于细胞间期,有丝分裂期stathmin磷酸化水平显著增高,其氨基末端的四个丝氨酸经细胞周期素依赖激酶、有丝分裂原活化蛋白激酶、钙调蛋白依赖激酶和cAMP依赖激酶等蛋白激酶作用磷酸化。研究证实,诱导野生型stathmin过表达将导致细胞间期微管解聚。当这些细胞进入有丝分裂早期,stathmin经磷酸化失活,从而使微管蛋白聚合及纺锤体装配。有丝分裂晚期stathmin的去磷酸化对于纺锤体的解体和退出有丝分裂是必需的。激酶靶点发生突变的stathmin突变体表达时,细胞不能使stathmin磷酸化,微管不能够聚合并形成有功能的纺锤体。这些研究结果表明stathmin的磷酸化失活对纺锤体的形成和细胞周期的进行是至关重要的。Stathmin的高水平表达可以在白血病、淋巴瘤、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、成骨肉瘤、乳腺癌等多种肿瘤中检测到。Alli等发现含有突变型p53基因的人乳腺癌细胞系中stathmin表达增加。Mistry等进一步研究实验肿瘤模型中致癌基因介导的转化对stathmin表达水平的影响,推测在肿瘤细胞中经常观测到stathmin的高水平表达仅仅是肿瘤细胞增殖活动增强的一种反映。其后的研究证实,stathmin的高水平表达对于维持肿瘤细胞的高增殖率是必需的。通过妨碍微管功能抑制细胞分裂的药物目前已广泛应用于肿瘤的化疗,紫杉醇和长春碱是此常用的两种化疗药物。研究证实stathmin的过表达与肺癌细胞对长春地辛敏感相关,可作为肺癌患者对长春碱类药物敏感的标志。Balachandran等证实紫杉醇（泰素）与抗stathmin核酶联合治疗可以提供一种更有效、低毒的肿瘤治疗手段,从而大大减轻多种化疗药物联合应用导致的重叠蓄积毒性。由于stathmin蛋白在纺锤体调节和细胞转化中的重要作用,stathmin基因及其表达产物是一个极具吸引力的恶性肿瘤生物治疗新靶点,stathmin已成为肿瘤基因治疗的一个很有吸引力的分子目标。近年来,stathmin基因治疗在实验中不断取得成功。由于stathmin在所有转化细胞中本质上都有高水平的表达,stathmin可以成为肿瘤治疗中非常好的生物治疗靶点,其与微管作用化疗药物紫杉醇等联合应用有着广阔的前景。为此,本研究以纯化的重组stathmin蛋白为免疫原,利用经典的淋巴细胞融合技术,建立了稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,对得到的单克隆抗体进行了纯化和鉴定,并用Western-Blot和免疫组织化学实验对所制备的抗体进行了验证,进一步研究了抗stathmin单克隆抗体联合紫杉醇对人肝癌HepG2细胞的生长抑制作用,为进一步研究stathmin蛋白的功能以及临床应用奠定了基础。目的制备人微管不稳定蛋白（stathmin）的单克隆抗体,对其特异性进行鉴定,并探讨抗人stathmin单克隆抗体、紫杉醇单用及联用对肝癌细胞系HepG2的生长抑制作用。方法1.材料BALB/c小鼠,雌性,6～8周龄,约20g,购自广州中山大学实验动物中心。SP2/0骨髓瘤细胞、肝癌细胞株QGY7703和HepG2为南方医科大学抗体工程研究所实验室传代保存。作为免疫原纯化的stathmin蛋白为南方医科大学抗体工程研究所提供。2.实验步骤实验分两部分进行:2.1抗人stathmin蛋白单克隆抗体的制备及鉴定2.1.1动物免疫选用BALB/c小鼠,雌性,6～8周龄,20g左右。用纯化的蛋白免疫,用间接ELISA检测血清抗体效价达1:6 400以上。2.1.2细胞融合取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,50%PEG溶液为融合剂,融合细胞用HAT做选择性培养,第7d后改用HT培养基,第17d后改用普通RPMI-1640培养基培养。2.1.3诱生腹水和抗体的纯化在预先1周注射石蜡油致敏的BALB/c小鼠腹腔接种已建株的杂交瘤细胞,10d后采集腹水并离心,取上清,将腹水上清过滤稀释后,通过Protein-G亲和层析柱纯化,并用SephadexG50柱进行脱盐,收集蛋白峰SDS—PAGE分析纯化结果。2.1.4 Western-Blot分析培养人肝癌细胞系HepG2及QGY7703,取1×10⁷个细胞,液氮速冻2min后,取出加入600μl 1×SDS上样缓冲液,沸水5min,10000r/min离心5min。按顺序上样后,分别加入不同的一抗,再加入二抗（HRP标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体）。加入化学发光底物反应液处理后,放入X线摄影暗盒,在暗房中显影并定影。2.1.5免疫组织化学分析收集经手术切除的病理证实为原发性肝癌的组织标本,用制备的单克隆抗体进行免疫组化染色以分析stathmin蛋白在原发性肝癌组织中的表达情况。免疫组化的染色方法参照SABC试剂盒说明书的步骤进行操作,对照组以PBS代替第一抗体。2.2抗人stathmin单克隆抗体及其联合紫杉醇对人肝癌细胞的生长抑制作用2.2.1细胞培养人肝癌细胞HepG2细胞在37℃、5%的CO₂孵箱中培养,培养液为含10%灭活小牛血清的RPMI-1640,含1%的双抗,每3～4 d传代1次,并取对数生长期的细胞用于实验。2.2.2倒置显微镜观察HepG2细胞形态的变化取对数生长期HepG2细胞,2×10⁵/孔接种于6孔板,4 h后加入不同浓度的stathmin单克隆抗体、不同浓度的紫杉醇,以及两者联合用药,各组处理24、48、72、96 h后在倒置显微镜下连续观察细胞形态学变化并拍摄记录细胞形态。2.2.3 MTT法检测stathmin单克隆抗体联合紫杉醇对HepG2细胞的生长抑制作用取对数生长期HepG2细胞,以5×10³/孔接种于96孔板,37℃、5%CO₂培养4 h后加入药物。实验分组:stathmin单克隆抗体组、紫杉醇组,联合用药组,另设不加药的对照组,每个剂量设5个复孔。分别培养24、48、72、96 h后每孔加入MTT,继续培养4 h。终止培养,弃上清,每孔加150μl DMSO,使结晶物充分融解,用酶标仪测定各孔的OD值,计算细胞增殖抑制率。2.2.4统计学处理采用SPSS13.0软件处理系统进行统计学分析。不同浓度抗人stathmin单克隆抗体、不同浓度紫杉醇以及两者联合用药组对HepG2细胞抑制率的均数比较、交互效应分析采用析因方差分析,同一浓度下不同作用时间间两两比较、同一时间下不同浓度间两两比较采用One-way ANOVA分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。结果一、成功筛选并制备出2株抗stathmin的单克隆抗体细胞株。二、经间接ELISA法检测2株单克隆抗体培养上清的效价分别为1:512和1:256,按照HyCultBiotechnology产品说明书,得到2株细胞分泌的单抗均为IgG1,轻链均为κ链。三、经Western-blot鉴定,抗stathmin的2株单克隆抗体细胞培养上清均能和人肝癌细胞株（HepG2和QGY7703）发生特异性反应。经免疫组化鉴定,两株抗sathmin单克隆抗体与原发性肝癌组织反应后均能生成棕色或棕褐色沉淀,主要位于肝癌细胞的胞质,阴性对照未见棕色或棕褐色沉淀。四、抗stathmin单克隆抗体、紫杉醇单用及联用对HepG2细胞都具有明显的抑制作用,随着药物浓度的增加和作用时间的延长,这种抑制作用也逐渐增强,并且呈现一定的时间剂量依赖关系;而且联用比单用显示出更强的抑制作用,表明两者有明显的协同作用。结论本实验运用杂交瘤技术成功筛选并制备出2株抗stathmin的单克隆抗体细胞株,并对其特异性进行鉴定,经Western-blot和免疫组织化学鉴定,显示制备的2株单克隆抗体均能和人肝癌细胞株以及人原发性肝癌病理标本发生特异性反应,表明制备的单克隆抗体特异性针对stathmin。进一步利用MTT法测定抗stathmin单克隆抗体联合紫杉醇对人肝癌细胞的生长抑制作用,表明抗人stathmin单克隆抗体、紫杉醇单用及联用对HepG2细胞增殖的抑制作用均呈时间和浓度依赖性,随浓度的增加和作用时间的延长,其对细胞增殖的抑制作用逐渐增强,联用比单用显示出更强的生长抑制作用,提示两者有交互协同作用。