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背景白癜风是临床上常见的一种色素脱失性皮肤病,全球发病率约为1%。该病发病机制复杂。目前研究认为,各种原因导致的皮肤局部微环境中氧化-抗氧化平衡失调,氧化应激产物蓄积,导致黑素细胞损伤甚至凋亡,是白癜风发病的重要原因之一。活性氧（ROS）是一组氧化剂,是评价机体氧化应激的重要指标。ROS水平升高会引起细胞氧化应激,从而导致细胞损伤或死亡。白癜风患者的血液和皮损中ROS水平显著升高。核因子E2相关因子2-抗氧化反应元件（Nrf2-ARE）信号通路是人体内最重要的抗氧化反应通路。受到ROS刺激后,Nrf2水平增高,并进入细胞核与抗氧化反应元件（ARE）结合,启动ARE下游多种靶蛋白的表达,包括Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶、蛋白酶体/分子伴侣等。Ⅱ相解毒酶如谷胱甘肽S转移酶（GST）、抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、血红素氧合酶-1（HO-1）、硫氧还蛋白1（Trxl）、过氧化物还原酶-2（Prx-2）在抗氧化调节中均发挥了重要作用。另外蛋白酶体/分子伴侣如热休克蛋白（HSP）,可以协助新生肽链正确折’叠组装成功能蛋白,在抗氧化功能蛋白酶的正确合成过程中也发挥重要的作用。研究显示,白瘢风皮损处Nrf2及其下游多个Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因表达上调,白癜风患者体内的GST、SOD、HO-1和HSP70水平异常表达,证实Nrf2及其下游基因参与了白癜风皮损处稳态的维持。Nrf2-ARE通路及其下游的多种蛋白酶在保护人黑素细胞避免氧化应激损伤中发挥重要作用。多种原因引起的黑素细胞凋亡是白癜风发病的启动因素之一。抗氧化剂可减轻H202诱导的黑素细胞凋亡。既往对多种组织及细胞研究提示,Nrf2-ARE信号通路的激活、下游抗氧化蛋白酶的上调不仅有抗氧化作用,还对细胞凋亡具有保护作用。谷氨酰胺（Gin）是人体中含量最丰富的游离氨基酸,参与一系列新陈代谢过程。近年来Gin的抗氧化作用越来越受到关注,Gin能为细胞内的抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）提供合成前体,并使其维持在还原状态;Gin能够增加体内抗氧化酶水平并减少氧化代谢产物的生成;Gin能够抑制因氧化应激造成的细胞凋亡与损伤;Gln也可以通过提高HSP表达,防止细胞凋亡等作用来减少氧化应激状态下的组织损伤。Gin在多种疾病中都表现出抗氧化和抗细胞凋亡作用。但是,目前Gln对白癜风患者或黑素细胞的作用尚不清楚。目的1.建立黑素细胞氧化应激模型,筛选合适的Gln处理浓度。2.探讨Gln对黑素细胞氧化应激模型的抗氧化蛋白和凋亡因子的作用。3.探讨Gln是否通过激活黑素细胞Nrf2-ARE通路发挥抗氧化和抗细胞凋亡作用。方法1.黑素细胞氧化应激模型的建立取正常人包皮组织进行黑素细胞原代培养。Dopa染色鉴定黑素细胞。用浓度0-2 mmol/H2O2处理黑素细胞24h,CCK-8法检测细胞活力,并根据检测结果选用适当浓度的H2O2对黑素细胞进行氧化应激造模。2.Gln的剂量筛选将黑素细胞分为以下三大组:Gln组:仅用含不同浓度Gln（0.5-60mmol/L）的M254 培养基培养黑素细胞;Gln-H2O2组:先用含不同浓度Gin（0.5-60mmol/L）的M254培养基培养黑素细胞24h后,再使用0.75mmol/L的H202处理黑素细胞24h;H2O2-Gln组:先用0.75mmol/L的H2O2处理黑素细胞24h后,再使用含不同浓度Gln（0.5-60mmol/L）的M254培养基培养黑素细胞24h。各组均于第72h在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照,用CCK-8法测定细胞活力。同样处理Gln-H202组和H2O2-Gln组,并检测各组细胞的ROS水平。并根据实验结果选定后续实验的Gln浓度。3.Gln对MDA和LDH的影响将黑素细胞随机分为以下8组:第1组为正常对照组;第2组为黑素细胞氧化应激模型组:第3～7组分别为不同浓度Gin（2,5,10,15,20 mmol/L）预处理的黑素细胞氧化应激模型组;第8组为Gin（15mmol/L）后处理的黑素细胞氧化应激模型组。干预结束,检测细胞MDA水平和LDH释放率。4.Gln对黑素细胞各抗氧化蛋白的影响分组同上。检测细胞SOD活力、GST浓度、细胞核的Nrf2以及细胞的HO-1、Trx1、Prx-2、HSP70 表达水平。5.Gin对黑素细胞凋亡相关指标的影响分组同上。检测细胞Caspase-3、Bax、Bcl-2的水平。6.检测ML-385阻断Nrf2后Gln对CCK-8、ROS、MDA水平和LDH释放率的影响将黑素细胞随机分为以下6组:对照组、Gln组、ML-385组、H2O2组、Gln+H202组和Gln+ML-385+.H2O2组。分别检测各组的CCK-8水平、ROS水平、MDA水平、LDH释放率。7.检测ML-385阻断Nrf2后Gin对黑素细胞各抗氧化蛋白的影响分组同上。检测各组的SOD和GST水平;细胞核Nrf2及细胞HO-1、Trxl、Prx-2、HSP70水平的表达。8.检测ML-385阻断Nrf2后Gin对黑素细胞凋亡相关指标的影响分组同上。分别检测各组的细胞凋亡相关指标Caspase-3、Bax和Bcl-2。结果1.黑素细胞氧化应激模型的建立不同浓度的H2O2（0-2 mmol/L）处理黑素细胞24小时后,CCK-8呈剂量相关性降低趋势,0.75 mmol/L H2O2使CCK-8降低至正常细胞的50%左右。因此我们选用0.75 mmol/L H2O2刺激黑素细胞建立氧化应激模型。2.Gln的剂量筛选Gln的剂量筛选结果发现,30 mmol/L及以下浓度的Gin对正常黑素细胞形态及CCK-8均无明显影响。0.5-60 mmol/L的Gin预处理和后处理H202作用后的黑素细胞结果显示,0.75 mmol/L的H2O2处理24h后,细胞胞体皱缩、变圆,树突缩短、消失,CCK-8降低,ROS增高,2-40 mmol/L Gin预处理或者5-25 mmol/L Gln后处理均可使黑素细胞的树突增多、变长,CCK-8显著增高,2-30 mmol/L Gin预处理或者5-25 mmol/L Gin后处理均可使细胞ROS降低,对细胞有保护作用,其中15mmol/L Gin对细胞形态和细胞活力的保护作用最为明显。1 0～40mmol/L浓度范围内,同等剂量的Gln预处理效果优于后处理。因此我们选用了 2,5,10,15,20mmol/L的Glh预处理和15 mmol/L的Gln后处理进行后续的实验。3.Gin对细胞MDA水平和LDH释放率的影响黑素细胞氧化应激模型组的MDA水平、LDH释放率显著增高（P<0.01）。与模型组相比,5-20mmol/L的Gin预处理（P<0.01）和15mmol/L Gin后处理（P<0.05）均能显著降低黑素细胞的MDA水平;2mmol/L Gln.预处理（P<0.05）、5-20mmol/L的 Gln预处理组（P.<0.01）和 15mmol/L.Gln 后处理组（P<0.01）的 LDH释放率显著降低。其中15mmol/L Gin组细胞MDA水平及LDH释放率的降低最为明显（P<0.01）。4.Gin对黑素细胞各抗氧化蛋白的影响与正常对照组相比,黑素细胞氧化应激模型组的SOD水平显著降低,GST水平及 Nrf2、HO-1、Trx1、Prx-2、HSP70 表达显著增高（P<0.01）。与模型组相比,5 mmol/L Gin预处理（P<0.05）以及10-20mmol/L的Gin预处理组和15mmol/L Gin后处理组（P<0.01）均能使SOD及GST水平显著增高;5-20mmol/L的Gin预处理和15mmol/L Gin后处理均能显著增高黑素细胞Nrf2的表达水平（P<0.01）;2-20mmol/L的Gln预处理和15mmol/L Gin后处理均能显著增高黑素细胞HO-1、Trx1、Prx-2、HSP70的表达水平（P<0.01）。其中,15mmo1/L Gln预处理组的各项指标表达水平最高（P<0.01）。5.Gin对黑素细胞凋亡相关指标的影响黑素细胞氧化应激模型组的Caspase-3、Bax水平较正常对照组显著增高（P<0.01）,Bcl-2水平较正常对照组显著降低（P<0.01）。与模型组相比,2-20mmol/L的Gin预处理和15mmol/L Gin后处理的Caspase-3、Bax水平显著降低（P<0.01）,Bcl-2水平显著增高（P<0.01）。其中,15mmol/L Gin预处理组的各项指标水平变化最为明显（P<0.01）。6.ML-385阻断Nrf2后Gin对CCK-8、ROS、MDA水平和LDH释放率的影响结果显示Gin组和ML385组的CCK-8水平、ROS水平、MDA水平和LDH释放率均与正常对照组无统计学差异。H2O2组CCK-8水平较正常对照组明显降低（P<0.01）,ROS水平、MDA水平和LDH释放率较正常对照组显著增高（P<0.01）。Gln+H202 组的 CCK-8 水平均较 H202组显著增高（P<0.01）,ROS水平、MDA水平和 LDH释放率均较H202组显著降低（P<0.01）。Gln+ML385+H202 组的 CCK-8 水平较 Gln+H202组明显降低（P<0.01）,ROS 水平（P<0.01）、MDA 水平（P=0.01）和 LDH 释放率（P<0.01）均较 Gln+H202组明显增高。7.ML-385阻断Nrf2后Gin对黑素细胞各抗氧化蛋白的影响结果显示Gin组和ML385组的SOD活性、GST水平、Nrf2、HO-1、Trx1、Prx-2及HSP70表达与正常对照组无统计学差异。H202组SOD水平较正常对照组显著降低（P<0.01）,GST、Nrf2、HO-1、Trx1、Prx-2 及 HSP70 表达水平较正常对照组显著增高（P≤0.01）。Gln+H2O2组的各项指标水平均较H202组显著增高（P<0.01）。Gln+ML385+H202组的各项指标水平较Gln+H202组明显降低（P<0.01）。8.ML-385阻断Nrf2后Gin对黑素细胞凋亡相关指标的影响结果显示Gin组和ML385组的Caspase-3、Bax和Bcl-2水平与正常对照组无统计学差异。H202组Caspase-3和Bax水平较正常对照组显著增高,而Bcl-2水平显著降低（P<0.01）。Gln+H202组的Caspase-3和Bax水平较H2O2组显著降低,而Bcl-2水平显著增高（P<0.01）。Gln+ML385+H202组的Caspase-3和Bax水平较Gln+H2O2组明显增高,而Bcl-2水平显著降低（P<0.01）。结论Gin通过激活黑素细胞Nrf2-ARE信号通路,提高通路下游多种抗氧化蛋白的表达,调节细胞凋亡相关蛋白的表达,减少细胞损伤,增加细胞活力,维持细胞的正常形态,对氧化应激诱导损伤的黑素细胞具有保护作用。且该作用呈剂量相关趋势,15mmol/L的Gin预处理效果最佳。