【摘 要】
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高温作为一种物理诱变方式,可诱导孢子发生过程中异常细胞学行为,从而导致配子体加倍。本研究以油茶良种‘华金’为材料,围绕高温处理对油茶花粉母细胞减数分裂行为的影响,通过细胞学行为观察和转录组测序分析,开展了油茶花粉母细胞减数分裂时间节点的即时判别、高温处理下花粉母细胞减数分裂时期染色体行为、细胞板形成和胞质分裂观察以及细胞周期蛋白、微管蛋白和胞质分裂相关差异表达基因的筛选、功能注释和荧光定量分析研究
【基金项目】
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国家自然科学基金委青年科学基金项目“CoMKK6基因参与高温诱导油茶2n花粉形成的作用机制(32101489)”; 湖南省自然科学基金青年基金项目“油茶多倍化形成的细胞遗传学机制(2020JJ5969)”; 湖南省林业局省林业科技创新项目“油茶等木本油料高效培育及高值化利用技术研究(XLK202101-2)”; 中南林业科技大学引进人才科研启动基金项目“油茶未减数花粉自发形成的遗传学机理(2018
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高温作为一种物理诱变方式,可诱导孢子发生过程中异常细胞学行为,从而导致配子体加倍。本研究以油茶良种‘华金’为材料,围绕高温处理对油茶花粉母细胞减数分裂行为的影响,通过细胞学行为观察和转录组测序分析,开展了油茶花粉母细胞减数分裂时间节点的即时判别、高温处理下花粉母细胞减数分裂时期染色体行为、细胞板形成和胞质分裂观察以及细胞周期蛋白、微管蛋白和胞质分裂相关差异表达基因的筛选、功能注释和荧光定量分析研究。主要研究结果如下:(1)油茶花粉母细胞减数分裂时间节点的即时判别,是高温处理诱导小孢子染色体加倍的前提。细胞学观察表明,油茶枝条上不同位置的花芽之间的花药以及单个花芽的不同花药发育都具有明显的不同步性。长雄蕊小孢子发生的减数分裂阶段与短雄蕊小孢子发生的减数分裂阶段无显著相关性,说明减数分裂进程与花丝长度没有相关性。(2)油茶花粉母细胞与花柱长度及花芽外部形态有密切的关系。在固定花柱长度范围内虽可以观察到不同的减数分裂阶段,但处于不同发育阶段的花粉母细胞之间比率差异显著。当花柱生长到大于1.97mm时,花粉母细胞进入减数分裂;当花柱生长到大于2.87mm时,花粉母细胞结束减数分裂,处于小孢子时期。随着孢母细胞的发育,花芽宽长比呈“s”形,从0.53增大到0.56,然后再小孢子阶段减小到0.54。在减数分裂结束和四分体形成之前,没有明显的伸长现象,发育至四分体时期时,花芽的宽度与长度之比达到最大值0.56。(3)在花粉母细胞各减数分裂阶段,通过不同程度的高温处理发现,高温能有效诱导油茶形成2n花粉。细线期至双线期与双线期至终变期都是高温处理油茶产生2n花粉的有效处理时期,处于这两个时期的花芽比率与2n花粉得率存在显著的正相关关系(r=0.8632,P=0.0123和r=0.8644,P=0.0121)。不同温度处理下2n花粉得率存在显著差异,45℃高温持续处理4h、5h后,2n花粉诱导率可分别达9.44%和6.19%,47℃高温持续处理4h、5h后,2n花粉诱导率可分别达6.27%和9.22%。45℃和47℃高温处理比43℃和49℃处理效果更好。(4)高温处理对油茶染色体行为、胞质分裂和细胞板形成具有重要影响。通过显微观察,发现高温处理后花粉母细胞染色体行为和细胞板的形成存在异常现象,包括单价染色体、染色体凝聚缺陷、赤道外染色体、染色体提前分离、落后染色体和染色体不同步分离;在四分体时期存在胞质不均衡分配的现象,形成了二分体,三分体和多分体;细胞板呈现单孔状,或平分细胞质,或呈“人”字型,或呈“十”字型。(5)使用Illumina Hiseq高通量测序平台对油茶对照组及各高温温度持续处理5h实验组进行转录组测序分析,共检测出100,202个Unigene基因。利用COG数据库、Swiss-Prot数据库、KOG数据库等筛选出细胞周期蛋白、微管蛋白和胞质分裂相关基因共20个。表达量聚类热图分析发现,45℃和47℃高温处理组大部分基因呈现下调表达趋势。qPCR反应表明,MKK6、MMD1、MOR1和TPX2基因对高温的响应非常灵敏,在43℃、45℃、47℃高温处理下显著下调表达或极显著下调表达,在49℃高温处理下对比于其他温度处理MKK6、MMD1、MOR1和TPX2基因的相对表达量均处于较高水平。
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