研究目的肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC,简称肝癌)是一种恶性程度非常高的肿瘤,因其起病隐匿、进展迅速,病死率在全世界恶性肿瘤中居第二位。虽然手术切除、肿瘤血管栓塞和射频消融等治疗方式有效地提高了肝癌患者的生存率,但是多数患者终因肝癌侵袭进展,预后极差。从分子水平探索肝癌的发病机制,寻找影响其发生和进展的关键分子,评估其成为分子标记物和干预靶点的可能性,将为发现并鉴定新型治疗靶点,制定有效的治疗策略奠定理论基础。TRIM7(tripartite motif-containing protein 7)是 2002 年被首次鉴定的 TRIM 家族新成员,由于其可以结合并激活糖原蛋白,在糖原的生物合成中发挥启动作用,因而最初被定义为糖原蛋白结合蛋白(glycogenin interacting protein,GNIP)。TRIM7具有高度保守的RBCC结构序列,从N端到C端依次是RING结构域、一个B-box结构域、一个Coiled-coil结构域和一个C端的B30.2/SPRY结构域。由于TRIM7含有RING锌指结构域,因而可能具有E3泛素连接酶活性。目前有关TRIM7分子的报导很少,其在肝癌中的表达情况、生物学效应和分子机制尚不清楚。本研究通过临床标本检测、肝癌细胞模型以及肝癌异种移植瘤小鼠动物模型,深入探讨了 TRIM7在肝癌进展中的作用效应及分子机制,为肝癌临床治疗策略的完善提供了新思路。研究方法1.研究TRIM7在肝癌组织及其对应的远端非癌肝组织中的表达水平1.1检测TRIM7在肝癌组织中的表达定位和表达水平应用免疫组织化学染色(immunohistochemistry,IHC)实验检测80例临床肝癌患者的肝癌组织及其相匹配的远端非癌肝组织中TRIM7的表达定位和表达水平,并进行统计分析。1.2检测TRIM7在肝癌组织中的蛋白表达水平应用免疫蛋白印迹(western blot)实验检测52例临床肝癌患者的肝癌组织及其对应的远端非癌肝组织中TRIM7的蛋白表达水平,并进行统计分析。1.3检测TRIM7在肝癌组织中的mRNA水平应用实时定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)检测64例临床肝癌患者的肝癌组织及其对应的远端非癌肝组织中的TRIM7的mRNA水平,并进行统计分析。2.研究TRIM7对肝癌细胞恶性行为能力的影响2.1构建TRIM7过表达的肝癌细胞模型2.1.1构建TRIM7瞬时过表达的肝癌细胞模型在HepG2和Huh7肝癌细胞中转染带有Flag标签的TRIM7质粒(Flag-TRIM7),对照组肝癌细胞中转染带有Flag标签的空白表达载体质粒(Flag-pENTER),转染24 h后,应用western blot检测TRIM7的蛋白表达水平,以判断TRIM7瞬时过表达的肝癌细胞模型是否构建成功。2.1.2构建TRIM7稳定过表达的肝癌细胞系在Huh7肝癌细胞中转染Flag-TRIM7质粒,对照组肝癌细胞中转染Flag-pENTER质粒,转染48 h后,更换为含有嘌呤霉素的全培养基进行筛选,将存活的单细胞克隆进行扩大培养,应用western blot检测TRIM7稳定过表达是否成功,筛选TRIM7稳定过表达的Huh7肝癌细胞株。2.2检测过表达TRIM7对肝癌细胞增殖、侵袭和克隆形成能力的影响在成功构建的TRIM7瞬时过表达的HepG2和Huh7肝癌细胞模型和TRIM7稳定过表达的Huh7肝癌细胞模型及其相应的肝癌细胞对照组中,应用CCK-8、Transwell和克隆形成实验分别检测瞬时和稳定过表达TRIM7对肝癌细胞增殖、侵袭和克隆形成能力的影响。2.3构建抑制或敲除TRIM7的肝癌细胞模型2.3.1构建Si-TRIM7瞬时转染的肝癌细胞模型在HepG2和Huh7肝癌细胞中各分别转染两条不同的TRIM7小干扰RNA(Si-TRIM7-1和Si-TRIM7-2)以干扰TRIM7的表达,对照组肝癌细胞转染非特异性序列(Si-NC)。转染48小时后,应用western blot检测TRIM7的蛋白表达水平,以判断Si-TRIM7瞬时转染的肝癌细胞模型是否构建成功。2.3.2构建慢病毒介导的Sh-TRIM7稳定转染的肝癌细胞系在Huh7肝癌细胞中分别转染慢病毒介导的两条不同的靶向TRIM7的ShRNA(Sh-TRIM7-1和Sh-TRIM7-2),对照组肝癌细胞中转染病毒包被的非特异性序列(Sh-NC),转染48小时后,更换为含有嘌呤霉素的全培养基进行筛选,将存活的单细胞克隆进行扩大培养,应用western blot检测TRIM7是否稳定敲低,筛选TRIM7稳定敲低的Huh7肝癌细胞株。2.3.3构建基于CRISPR/Cas9系统的TRIM7基因敲除的肝癌细胞系应用CRISPRdirect网站设计三对用于构建single-guide RNA(sgRNA)的oligo序列,将合成的oligo序列退火形成退火产物。将pLentiCRISPRv2载体酶切线性化。将退火后的oligo和酶切后的载体连接成为重组质粒。将三条重组质粒分别转染入Huh7肝癌细胞中,对照组肝癌细胞转染pLenti-V2空载体质粒。转染48小时后,应用western blot检测TRIM7的蛋白表达水平,以判断sgRNA是否能成功敲除TRIM7。选择敲除效率最高的重组质粒,将其转染入Huh7肝癌细胞中,对照组肝癌细胞转染pLenti-V2空载体质粒。转染48小时后,更换为含有嘌呤霉素的全培养基进行筛选,将存活的单细胞克隆进行扩大培养,应用western blot检测TRIM7敲除是否成功,筛选TRIM7成功敲除的Huh7肝癌细胞株。2.4检测抑制或敲除TRIM7对肝癌细胞增殖、侵袭和克隆形成能力的影响在成功构建的Si-TRIM7瞬时转染的HepG2和Huh7肝癌细胞模型、慢病毒介导的Sh-TRIM7稳定转染的Huh7肝癌细胞系和基于CRISPR/Cas9系统的TRIM7基因敲除的Huh7肝癌细胞系及其相应的肝癌细胞对照组中,应用CCK-8、Transwell和克隆形成实验分别检测抑制或敲除TRIM7对肝癌细胞增殖、侵袭和克隆形成能力的影响。3.研究TRIM7在肝癌细胞中发挥抑癌效应的分子靶点本课题为了研究TRIM7在肝癌细胞中发挥调控效应的分子靶点,应用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)实验对可能与TRM7发生结合的原癌或抑癌分子进行筛选,包括 Src、p53、TSC2、HIF-1α、SNAIL、MMP-9 和 Racl等。结果提示,TRIM7可以与原癌分子Src发生直接结合。3.1研究TRIM7与Src的相互结合效应3.1.1检测外源性TRIM7与外源性Src的相互结合效应在HEK293T细胞和Huh7肝癌细胞中共转染Flag-TRIM7和带HA标签的Src质粒(HA-Src),对照组细胞中共转染Flag-pENTER空载体和HA-Src质粒,应用Co-IP实验检测外源性TRIM7与外源性Src的相互结合情况。3.1.2检测外源性TRIM7与内源性Src的相互结合效应在HEK293T细胞和Huh7肝癌细胞中转染Flag-TRIM7质粒,对照组细胞中转染Flag-pENTER空载体质粒,应用Co-IP实验检测外源性TRIM7与内源性Src的相互结合情况。3.1.3检测内源性TRIM7与内源性Src的相互结合效应在Huh7肝癌细胞中,应用TRIM7抗体进行Co-IP实验,检测内源性TRIM7和内源性Src在肝癌细胞中的相互结合情况。进一步在Huh7肝癌细胞中,应用Src抗体进行Co-IP实验,检测内源性Src和内源性TRIM7在肝癌细胞中的结合情况。3.1.4检测TRIM7与Src在体外的直接结合作用应用蛋白质体外转录与翻译体系分别合成HA-Src和Flag-TRIM7蛋白,应用Co-IP实验检测Flag-TRIM7和HA-Src在体外的直接结合效应。3.2研究介导TRIM7与Src相互结合的结构域3.2.1检测介导TRIM7与Src结合的TRIM7结构域构建一系列TRIM7结构域缺失的截短体,分别是TRIM7△RING、TRIM7△Poly-Ala、TRIM7△B-box、TRIM7△Coiled-coil 和 TRIM7△B30.2/SPRY。在HEK293T细胞中,分别将各个TRIM7截短体质粒与HA-Src质粒共转染,应用Co-IP实验检测Src与各个TRIM7截短体的结合情况,研究介导TRIM7和Src结合的TRIM7结构域。3.2.2检测介导Src与TRIM7结合的Src结构域构建一系列Src结构域缺失的截短体,分别是Src△SH3、Src△SH2和Src△ protein kinase。在HEK293T细胞中,分别将各个Src截短体质粒与Flag-TRIM7质粒共转染,应用Co-IP实验检测各个Src截短体与TRIM7的结合情况,研究介导Src和TRIM7结合的Src结构域。4.研究TRIM7对Src的调控效应4.1检测TRIM7对Src的蛋白表达水平及磷酸化水平的调控效应4.1.1检测过表达TRIM7对Src的蛋白表达水平及磷酸化水平的影响在成功构建的TRIM7瞬时过表达的HepG2和Huh7肝癌细胞模型和TRIM7稳定过表达的Huh7肝癌细胞系及其相应的肝癌细胞对照组中,应用western blot检测TRIM7、Src和p-Src(Tyr419)的水平,研究过表达TRIM7对Src的蛋白表达水平及磷酸化水平的影响。4.1.2检测抑制或敲除TRIM7对Src的蛋白表达水平及磷酸化水平的影晌在成功构建的Si-TRIM7瞬时转染的HepG2和Huh7肝癌细胞模型、慢病毒介导的Sh-TRIM7稳定转染的Huh7肝癌细胞系和基于CRISPR/Cas9系统的TRIM7基因敲除的Huh7肝癌细胞系及其分别的肝癌细胞对照组中,应用western blot检测TRIM7、Src和p-Src(Tyr419)的水平,研究抑制或敲除TRIM7对Src的蛋白表达水平及磷酸化水平的影响。4.2检测TRIM7对Src的mRNA水平的调控效应4.2.1检测过表达TRIM7对Src的mRNA水平的影响在HepG2和Huh7肝癌细胞中转染Flag-TRIM7质粒,对照组肝癌细胞中转染Flag-pENTER空载体质粒,应用real-time PCR检测TRIM7和Src的mRNA水平,研究过表达TRIM7对Src的mRNA水平的影响。4.2.2检测抑制TRIM7对Src的mRNA水平的影响在HepG2肝癌细胞中分别转染Si-TRIM7-1或Si-TRIM7-2,对照组肝癌细胞转染Si-NC,应用real-time PCR检测TRIM7和Src的mRNA水平,研究抑制TRIM7对Src的mRNA水平的影响。4.3检测肝癌组织中Src的表达水平及其与TRIM7表达水平的相关性在58例临床患者的肝癌组织中,应用IHC检测Src的表达水平,并统计分析肝癌组织中TRIM7和Src表达水平的相关性。4.4检测肝癌细胞中TRIM7对Src蛋白稳定性的调控效应在HepG2和Huh7肝癌细胞中转染Flag-TRIM7质粒,对照组肝癌细胞转染Flag-pENTER空载体质粒,转染24 h后应用放线菌酮(Cycloheximide,CHX)阻断肝癌细胞内蛋白的从头合成,设置CHX作用时间梯度(0 h、3 h、6 h和9 h),应用western blot检测各时间点Src的蛋白水平,并统计分析Src蛋白的降解趋势。4.5检测肝癌细胞中TRIM7介导Src蛋白降解的途径在HepG2肝癌细胞中转染Flag-TRIM7质粒,对照组肝癌细胞转染Flag-pENTER空载体质粒,转染24 h后在Flag-TRIM7质粒转染组分别应用蛋白酶体抑制剂MG132或溶酶体抑制剂氯喹(Chloroquine)抑制蛋白酶体或溶酶体的活性,应用western blot检测Src和p-Src(Tyr419)的水平,研究抑制蛋白酶体或溶酶体活性对TRIM7介导的Src的降解作用的影响,探讨TRIM7介导Src降解的途径。5.研究TRIM7对Src蛋白的泛素化修饰作用5.1检测TRIM7对Src蛋白是否存在泛素化修饰作用5.1.1检测外源性TRIM7对Src的泛素化修饰作用在HEK293T细胞中,共转染带HA标签的UB质粒(HA-UB)、Flag-TRIM7和HA-Src质粒,对照组细胞中共转染HA-UB、Flag-pENTER空载体和HA-Src质粒,应用Co-IP实验检测外源性和内源性Src的泛素化修饰状态。5.1.2检测外源性TRIM7对内源性Src的泛素化修饰作用在HEK293T细胞中,共转染HA-UB和Flag-TRIM7质粒,对照组细胞分别单独转染Flag-pENTER空载体、Flag-TRIM7或HA-UB质粒,应用Co-IP实验检测内源性Src的泛素化修饰状态。5.1.3检测TRIM7在体外对Src的泛素化修饰作用应用蛋白质体外转录与翻译系统分别合成HA-Src和Flag-TRIM7蛋白,在泛素结合反应缓冲液中,将体外合成的Flag-TRIM7和HA-Src蛋白与ATP、MgCl2、Ubiquitin、UBE1和UbcH5a(UBE2D1)共同孵育,在体外形成泛素化反应系统。应用western blot实验检测HA-Src在体外的泛素化修饰状态,以明确TRIM7是否能够对Src进行直接的泛素化修饰作用。5.2检测TRIM7介导Src发生泛素化修饰的类型K11、K48和K63位泛素化修饰是比较常见的泛素化修饰类型。HA-UB-K11、HA-UB-K48和HA-UB-K63质粒是野生型HA-UB质粒的位点突变体,分别仅保留了位于第1 1、48和63位的赖氨酸(Lys,K)残基,而用精氨酸(Arg,R)替代了其他位置的Lys残基。在HEK293T细胞中,分别将HA-UB-K11、HA-UB-K48或HA-UB-K63与Flag-TRIM7和HA-Src质粒进行共转染,对照组细胞中分别将 HA-UB-K11、HA-UB-K48 或 HA-UB-K63 与 Flag-pENTER 空载体和HA-Src质粒进行共转染,应用Co-IP实验检测Src的泛素化修饰状态,研究TRIM7介导Src泛素化修饰的类型。5.3检测RING结构域在TRIM7介导的Src泛素化修饰过程中的作用在HEK293T细胞中,共转染HA-UB质粒与带有Flag标签的RING结构域缺失的TRIM7截短体质粒(Flag-TRIM7 △ RING),阳性对照组细胞共转染HA-UB与野生型Flag-TRIM7质粒,阴性对照组细胞共转染HA-UB与Flag-pENTER空载体质粒,应用Co-IP实验检测Src的泛素化修饰状态,研究RING结构域在TRIM7介导的Src泛素化修饰过程中的作用。6.研究TRIM7在肝癌细胞中发挥抑癌效应的信号通路本课题为了研究TRIM7在肝癌中发挥调控效应的信号通路,对TRM7可能调控的信号通路进行了筛选,包括mTOR、AMPK、AKT、NF-Kappa B和MAPK等信号通路。结果提示,TRIM7显著抑制mTORC1-S6K1信号通路的活性。6.1检测肝癌细胞中TRIM7对mTORC1-S6K1信号通路的调控效应6.1.1检测过表达TRIM7对mTORC1-S6K1信号通路的影响在成功构建的TRIM7瞬时过表达的HepG2和Huh7肝癌细胞模型和TRIM7稳定过表达的Huh7肝癌细胞模型及其相应的肝癌细胞对照组中,应用western blot检测 TRIM7对Src 及 p-mTOR、p-S6K1、p-S6 和 p-4E-BP1 等 mTORC1-S6K1信号通路分子的调控效应,研究过表达TRIM7对Src及mTORC1-S6K1信号通路的影响。6.1.2检测抑制或敲除TRIM7对mTORC1-S6K1信号通路的影响在成功构建的Si-TRIM7瞬时转染的HepG2和Huh7肝癌细胞模型、慢病毒介导的Sh-TRIM7稳定转染的Huh7肝癌细胞系和基于CRISPR/Cas9系统的TRIM7基因敲除的Huh7肝癌细胞系及其相应的肝癌细胞对照组中,应用western blot 检测 TRIM7 对 Src 及 p-mTOR、p-S6K1、p-S6 和p-4E-BP1等mTORC1-S6K1信号通路分子的调控效应,研究抑制或敲除TRIM7对Src及mTORC1-S6K1信号通路的影响。6.2检测Src在TRIM7介导的对mTORC1-S6K1信号通路的抑制效应中的作用在过表达TRIM7的Huh7肝癌细胞中,外源性过表达Src,应用western blot验证Flag-TRIM7和HA-Src的表达水平,并检测p-Src(Tyr419)的水平和mTORC1-S6K1信号通路分子的磷酸化水平。在Huh7肝癌细胞中,分别转染Si-NC、Si-TRM7-1或Si-TRM7-2,应用雷帕霉素(Rapamycin)抑制mTORCI信号通路的活性,应用western blot验证TRIM7的表达水平和mTORC1-S6K1信号通路分子的磷酸化水平,并检测Src和p-Src(Tyr419)的水平。以此研究TRIM7对Src和mTORC1-S6K1信号通路调控效应的上下游关系,探讨Src在TRIM7介导的对mTORC1-S6K1信号通路的抑制效应中的作用。6.3检测TRIM7是否通过调控Src-mTORC1-S6K1信号轴发挥其抗肿瘤作用6.3.1检测TRIM7是否通过调控Src发挥其抗肿瘤作用在过表达TRIM7的HepG2和Huh7肝癌细胞中,外源性过表达Src,应用western blot 验证 Flag-TRIM7 和 HA-Src 的表达水平,应用 CCK-8、Transwell 和克隆形成实验分别检测HepG2和Huh7肝癌细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力。应用靶点恢复实验研究TRIM7是否通过对Src的负向调控效应发挥其对肝癌的抑癌效应。6.3.2检测TRIM7是否通过调控mTORCI-S6K1信号通路发挥其抗肿瘤作用在HepG2肝癌细胞中,分别转染Si-TRM7-1、Si-TRM7-2或Si-NC,应用雷帕霉素抑制mTORC1信号通路的活性,应用western blot检测TRIM7的表达水平、mTORC1-S6K1信号通路分子的磷酸化水平及Src和p-Src(Tyr419)的水平,应用CCK-8、Transwell和克隆形成实验分别检测HepG2肝癌细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力。应用信号通路验证实验检测TRIM7是否通过对mTORC1-S6K1信号通路的负向调控效应发挥其对肝癌的抑癌效应。7.研究TRIM7在肝癌细胞中发挥抑癌效应的功能性结构域我们的研究显示,TRIM7通过其B30.2/SPRY结构域介导与Src蛋白的直接结合,通过其RING结构域介导Src发生K48位泛素化修饰,并诱导其通过泛素-蛋白酶体途径降解。因此,RING结构域和B30.2/SPRY结构域是TRIM7发挥其功能的关键性结构域,我们将进一步探究TRIM7是否通过RING结构域和B30.2/SPRY这两个功能性结构域发挥对Src-mTORC1-S6K1信号轴的抑制效应及对肝癌的抑癌效应。7.1检测TRIM7是否通过其功能性结构域调控靶点及信号通路在Huh7肝癌细胞中分别转染带有Flag标签的RING或B30.2/SPRY结构域缺失的 TRIM7 截短体质粒(Flag-TRIM7 △ RING 和 Flag-TRIM7 △ B30.2/SPRY),阳性对照组肝癌细胞转染野生型Flag-TRIM7质粒,阴性对照组肝癌细胞转染Flag-pENTER 空载体质粒,应用 western blot 验证 Flag-TRIM7、Flag-TRIM7△RING 和 Flag-TRIM7△B30.2/SPRY 的表达水平,并检测 Src-mTORC1-S6K1 信号轴的活性,研究TRIM7是否通过其功能性结构域调控靶点及信号通路。7.2检测TRIM7是否是通过其功能性结构域在肝癌中发挥抑癌效应在HepG2和Huh7肝癌细胞中分别转染带有Flag标签的RING或B30.2/SPRY结构域缺失的TRIM7截短体质粒(Flag-TRIM7△RING和Flag-TRIM7△B30.2/SPRY),阳性对照组肝癌细胞转染野生型Flag-TRIM7质粒,阴性对照组肝癌细胞转染Flag-pENTER空载体质粒,应用western blot验证Flag-TRIM7、Flag-TRIM7△RING 和 Flag-TRIM7△B30.2/SPRY 的表达水平,应用 CCK-8、Transwell和克隆形成实验分别检测HepG2和Huh7肝癌细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力,研究TRIM7是否是通过其功能性结构域发挥对肝癌的抑癌效应。8.裸鼠肝癌异种移植瘤模型研究TRIM7对肝癌的作用效应和分子机制8.1应用TRIM7外源性过表达的裸鼠肝癌异种移植瘤模型研究TRIM7对肝癌的作用效应和分子机制取7只雄性裸鼠(5周大),将肝癌细胞(1 × 107细胞/侧)在裸鼠双侧腋窝进行皮下接种,以构建裸鼠肝癌异种移植瘤模型。待裸鼠腋下形成肉眼可见的肿瘤后,在裸鼠一侧腋下形成的肿瘤瘤内注射Flag-TRIM7质粒,同时在另一侧腋下对照组瘤内注射Flag-pENTER空载体质粒,隔天注射一次,由此构建TRIM7外源性过表达的裸鼠肝癌异种移植瘤模型。在裸鼠肝癌异种移植瘤生长的过程中,测量并计算瘤体大小,绘制瘤体的生长曲线。肉眼可见的肿瘤形成17天后,将裸鼠处死,对肿瘤进行分离。对裸鼠肿瘤的体积进行测量并计算,对裸鼠肿瘤的重量进行称量,并进行统计分析,检测外源性过表达TRIM7对裸鼠肿瘤的体积和重量的影响。将分离的裸鼠瘤体提取蛋白质,应用western blot检测裸鼠瘤体中TRIM7的表达水平和Src-mTORC1-S6K1信号轴的相关分子的活化水平,检测外源性过表达TRIM7对裸鼠肝癌异种移植瘤内Src-mTORC1-S6K1信号轴的影响。8.2应用TRIM7稳定过表达的裸鼠肝癌异种移植瘤模型研究TRIM7对肝癌的作用效应和分子机制取5只雄性裸鼠(5周大),将稳定过表达TRIM7的Huh7肝癌细胞及其对照组肝癌细胞(1×107细胞/侧)分别在裸鼠双侧腋窝进行皮下接种,由此构建肝癌细胞来源的TRIM7稳定过表达的裸鼠异种移植瘤模型。在裸鼠肝癌异种移植瘤生长的过程中,测量并计算瘤体大小,绘制瘤体的生长曲线。肉眼可见的肿瘤形成21天后,将裸鼠处死,对肿瘤进行分离。对裸鼠肿瘤的体积进行测量并计算,对裸鼠肿瘤的重量进行称量,并进行统计分析,检测稳定过表达TRIM7对裸鼠肿瘤的体积和重量的影响。将分离的裸鼠瘤体提取蛋白质,应用western blot检测裸鼠瘤体中TRIM7的表达水平和Src-mTORCI-S6K1信号轴相关分子的活化水平,检测稳定过表达TRIM7对裸鼠肝癌异种移植瘤内Src-mTORC1-S6K1信号轴的影响。8.3应用TRIM7敲除的裸鼠肝癌异种移植瘤模型研究TRIM7对肝癌的作用效应和分子机制取5只雄性裸鼠(5周大),将基于CRISPR/Cas9系统的TRIM7基因敲除的Huh7肝癌细胞及其对照组肝癌细胞(1 × 107细胞/侧)分别在裸鼠双侧腋窝进行皮下接种,由此构建肝癌细胞来源的TRIM7敲除的裸鼠异种移植瘤模型。在裸鼠肝癌异种移植瘤生长的过程中,测量并计算瘤体大小,绘制瘤体的生长曲线。肉眼可见的肿瘤形成21天后,将裸鼠处死,对肿瘤进行分离。对裸鼠肿瘤的体积进行测量并计算,对裸鼠肿瘤的重量进行称量,并进行统计分析,检测敲除TRIM7对裸鼠肿瘤的体积和重量的影响。将分离的裸鼠瘤体提取蛋白质,应用western blot检测裸鼠瘤体中TRIM7的表达水平和Src-mTORC1-S6K1信号轴的相关分子的活化水平,检测敲除TRIM7对裸鼠肝癌异种移植瘤内Src-mTORC1-S6K1信号轴的影响。研究结果1.与非癌肝组织相比,TRIM7在肝癌组织中的表达显著下调1.1肝癌组织中TRIM7的表达水平显著下调应用IHC检测TRIM7在肝癌组织及其相对应的远端非癌肝组织中的表达定位和表达水平。实验结果显示,TRIM7主要表达在肝癌细胞及远端非癌肝细胞的胞浆内。对IHC结果进行统计分析,结果显示,与远端非癌肝组织相比,TRIM7在肝癌组织中的表达显著降低。卡方检验结果显示,与相配对的非癌肝组织相比,肝癌组织中TRIM7的表达水平显著下调。1.2肝癌组织中TRIM7的蛋白表达水平显著下调应用western blot检测TRIM7在肝癌组织及其对应的远端非癌肝组织的蛋白表达水平,并进行统计分析。结果显示,与非癌肝组织相比,肝癌组织中TRIM7的蛋白表达水平显著下调。1.3肝癌组织中TRIM7的mRNA水平显著下调应用real-time PCR检测TRIM7在肝癌组织及其对应的远端非癌肝组织中的mRNA水平,并进行统计分析。结果显示,与非癌肝组织相比,肝癌组织中TRIM7的mRNA水平显著降低。2.TRIM7显著抑制肝癌细胞的恶性行为能力2.1过表达TRIM7显著抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力在成功构建的TRIM7瞬时过表达的HepG2和Huh7肝癌细胞模型和TRIM7稳定过表达的Huh7肝癌细胞模型及其相应的肝癌细胞对照组中,分别检测HepG2和Huh7肝癌细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力。结果显示,与对照组相比,瞬时或稳定过表达TRIM7能够显著降低HepG2和Huh7肝癌细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力。这表明过表达TRIM7能够对肝癌细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力产生显著的抑制效应。2.2抑制或敲除TRIM7显著增强肝癌细胞的增值、侵袭和克隆形成能力在成功构建的Si-TRIM7瞬时转染的HepG2和Huh7肝癌细胞模型、慢病毒介导的Sh-TRIM7稳定转染的Huh7肝癌细胞系和基于CRISPR/Cas9系统的TRIM7基因敲除的Huh7肝癌细胞系及其相应的肝癌细胞对照组中,分别检测Huh7肝癌细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力。结果显示,与对照组相比,抑制或敲除TRIM7能够显著提高Huh7肝癌细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力。这表明抑制或敲除TRIM7能够对肝癌细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力产生显著的增强效应。3.TRIM7与Src直接结合3.1 TRIM7与Src的相互结合效应3.1.1外源性TRIM7与外源性Src相互结合在HEK293T细胞和Huh7肝癌细胞中共转染Flag-TRIM7和HA-Src质粒,对照组细胞中共转染Flag-pENTER空载体和HA-Src质粒,进行Co-IP实验。结果显示,Flag-TRIM7与HA-Src发生结合。这表明外源性TRIM7与外源性Src相互结合。3.1.2外源性TRIM7与内源性Src相互结合在HEK293T细胞和Huh7肝癌细胞中转染Flag-TRIM7质粒,对照组细胞中转染Flag-pENTER空载体质粒,进行Co-IP实验。结果显示,Flag-TRIM7与内源性Src发生结合。这表明外源性TRIM7与内源性Src相互结合。3.1.3内源性TRIM7与内源性Src相互结合在Huh7肝癌细胞中,应用TRIM7抗体进行Co-IP实验,结果显示内源性TRIM7可以和内源性Src发生结合。进一步在Huh7肝癌细胞中,应用Src抗体进行Co-IP实验,结果显示,内源性Src可以和内源性TRIM7发生结合。这表明TRIM7和Src是肝癌细胞内互相结合的分子。3.1.4 TRIM7与Src在体外直接结合在蛋白质体外转录与翻译系统中分别合成Flag-TRIM7和HA-Src蛋白,将体外合成的两种蛋白混合,进行Co-IP实验。结果显示,体外合成的Flag-TRIM7与HA-Src蛋白可以在体外发生直接结合。这表明TRIM7与Src可以在体外发生直接结合。3.2 TRIM7的B30.2/SPRY结构域和Src的SH2结构域介导二者发生结合3.2.1 TRIM7通过B30.2/SPRY结构域介导与Src的结合作用构建一系列TRIM7结构域缺失的截短体。在HEK293T细胞中,分别将各个TRIM7截短体质粒与HA-Src质粒共转染,进行Co-IP实验。结果显示,B30.2/SPRY结构域缺失后,TRIM7失去了与Src发生结合的能力,而其它结构域缺失的TRIM7仍然能够与Src发生结合。这表明TRIM7的B30.2/SPRY结构域介导了其与Src的结合效应。3.2.2 Src通过SH2结构域介导与TRIM7的结合作用构建一系列Src结构域缺失的截短体。在HEK293T细胞中,分别将各个Src截短体质粒与Flag-TRIM7质粒共转染,进行Co-IP实验。结果显示,SH2结构域缺失后,Src失去了与TRIM7发生结合的能力,而其它结构域缺失的Src仍然能够与TRIM7发生结合。这表明Src的SH2结构域介导了其与TRIM7的结合效应。4.TRIM7对Src蛋白的负向调控效应4.1过表达TRIM7显著抑制Src的蛋白表达水平及磷酸化水平在成功构建的TRIM7瞬时过表达的HepG2和Huh7肝癌细胞模型和TRIM7稳定过表达的Huh7肝癌细胞模型及其相应的肝癌细胞对照组中,应用western blot检测Src和p-Src(Tyr419)的蛋白水平。结果显示,瞬时或稳定过表达TRIM7后,Src和p-Src(Tyr419)的水平显著下调。这表明过表达TRIM7显著抑制Src的蛋白表达水平及磷酸化水平。4.2抑制或敲除TRIM7显著提高Src的蛋白水平及磷酸化水平在成功构建的Si-TRIM7瞬时转染的HepG2和Huh7肝癌细胞模型、慢病毒介导的Sh-TRIM7稳定转染的Huh7肝癌细胞系和基于CRISPR/Cas9系统的TRIM7基因敲除的Huh7肝癌细胞系及其分别的对照组肝癌细胞中,应用western blot检测Src和p-Src(Tyr419)的水平。结果显示,抑制或敲除TRIM7后,Src和p-Src(Tyr419)的蛋白水平显著上调。这表明抑制或敲除TRIM7显著提高Src的蛋白水平及磷酸化水平。4.3 TRIM7不影响Src的mRNA水平4.3.1过表达TRIM7不影响Src的mRNA水平在HepG2和Huh7肝癌细胞中转染Flag-TRIM7质粒,对照组肝癌细胞中转染Flag-pENTER空载体质粒,进行real-time PCR实验。结果显示,干扰TRIM7表达后,Src的mRNA水平没有发生显著变化。4.3.2抑制TRIM7不影响 Src的mRNA水平在HepG2肝癌细胞中分别转染Si-TRIM7-1或Si-TRIM7-2,对照组肝癌细胞转染Si-NC,进行real-time PCR实验。结果显示,抑制TRIM7后,Src的mRNA水平没有发生显著的变化。上述结果显示,TRIM7能够对Src的蛋白表达水平产生显著的负向调控效应,但对Src的mRNA水平没有显著的影响。这提示,TRIM7对Src的负向调控效应发生在蛋白翻译水平,而非转录水平。4.4在肝癌组织中TRIM7与Src的表达水平呈显著负相关应用IHC检测58例临床患者的肝癌组织中Src的表达水平,并统计分析肝癌组织中TRIM7和Src表达水平的相关性。结果显示,肝癌组织中TRIM7和Src的表达水平呈显著的负相关。4.5 TRIM7促进Src蛋白的降解在HepG2和Huh7肝癌细胞中转染Flag-TRIM7质粒,对照组肝癌细胞转染Flag-pENTER空载体质粒,应用CHX阻断HepG2和Huh7肝癌细胞内蛋白的从头合成,应用western blot实验检测Src的蛋白水平。结果显示,过表达TRIM7后Src蛋白的降解速率显著提高。这表明TRIM7能够对Src蛋白的稳定性产生显著的破坏,对Src蛋白的降解产生显著的促进作用。4.6 TRIM7介导Src蛋白通过蛋白酶体途径降解在HepG2肝癌细胞中转染Flag-TRIM7质粒,分别应用蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂氯喹抑制蛋白酶体或溶酶体的活性,应用western blot实验检测Src的蛋白水平。结果显示,应用MG132抑制蛋白酶体活性之后,TRIM7失去了对Src的负向调控效应,而应用氯喹抑制溶酶体活性之后,TRIM7仍然能够对Src产生负向调控效应。这提示TRIM7通过蛋白酶体途径负向调控Src的蛋白水平。5.TRIM7通过RING结构域介导Src发生K48位泛素化降解5.1 TRIM7介导Src发生泛素化修饰5.1.1外源性TRIM7介导Src发生泛素化修饰在HEK293T细胞中,共转染HA-UB、Flag-TRIM7和HA-Src质粒,对照组细胞中共转染HA-UB、Flag-pENTER空载体和HA-Src质粒,应用Co-IP实验检测外源性和内源性Src的泛素化修饰状态。结果显示,外源性TRIM7能够将泛素链添加到Src上,提示TRIM7能够介导Src发生泛素化修饰。5.1.2外源性TRIM7介导内源性Src发生泛素化修饰在HEK293T细胞中,共转染HA-UB和Flag-TRIM7质粒,对照组细胞分别单独转染Flag-pENTER空载体、Flag-TRIM7或HA-UB质粒,应用Co-IP实验检测内源性Src的泛素化修饰状态。结果显示,外源性TRIM7能够将泛素链添加到内源性Src上,提示TRIM7能够介导内源性Src发生泛素化修饰。5.1.3 TRIM7在体外直接介导Src发生泛素化修饰应用蛋白质体外转录与翻译系统合成Flag-TRIM7蛋白和HA-Src蛋白,将二者与Ubiquitin、UBE1、UbcH5a(UBE2D1)、MgC12和ATP共同孵育,形成体外泛素化系统。应用western blot检测Src的泛素化修饰状态。结果显示,在体外泛素化系统中,TRIM7能够将泛素链添加到Src上。这表明TRIM7在体外直接介导Src发生泛素化修饰,提示TRIM7是直接介导Src发生泛素化修饰的E3泛素连接酶。5.2 TRIM7介导Src发生K48位泛素化修饰在 HEK293T 细胞中,分别将 HA-UB-K11、HA-UB-K48 或 HA-UB-K63 与Flag-TRIM7和HA-Src质粒进行共转染,对照组细胞中分别将HA-UB-K11、HA-UB-K48或HA-UB-K63与Flag-pENTER空载体和HA-Src质粒进行共转染。Co-IP结果显示,TRIM7能够将K48位泛素链添加到Src上。这表明TRIM7能够介导Src发生K48位泛素化修饰,并进一步验证了 TRIM7能够诱导Src通过泛素-蛋白酶体途径发生降解。5.3 TRIM7通过RING结构域介导Src发生泛素化修饰在HEK293T细胞中,共转染HA-UB与Flag-TRIM7 △ RING质粒,阳性对照组细胞共转染HA-UB与野生型Flag-TRIM7质粒,阴性对照组细胞共转染HA-UB与Flag-pENTER空载体质粒。Co-IP结果显示,RING结构域缺失的TRIM7不能将泛素链添加到Src上。这表明TRIM7通过RING结构域介导Src发生泛素化修饰。6.TRIM7通过抑制Src-mTORC1-S6K1信号轴对肝癌发挥抑癌效应6.1 TRIM7显著抑制mTORC1-S6K1信号通路的活化6.1.1过表达TRIM7显著抑制mTORC1-S6K1信号通路的活化水平在成功构建的TRIM7瞬时过表达的HepG2和Huh7肝癌细胞模型和TRIM7稳定过表达的Huh7肝癌细胞系及其相应的肝癌细胞对照组中,应用western blot检测 TRIM7、Src 及 p-mTOR、p-S6K1、p-S6 和 p-4E-BP1 等 mTORC1-S6K1 信号通路分子的蛋白水平。结果显示,瞬时或稳定过表达TRIM7后,Src的蛋白表达水平和mTORC1-S6K1信号通路分子的磷酸化水平显著下调。这表明,过表达TRIM7能够显著抑制Src的蛋白表达水平及mTORC1-S6K1信号通路的活化水平。6.1.2抑制或敲除TRIM7显著提高mTORC1-S6K1信号通路的活化水平在成功构建的Si-TRIM7瞬时转染的HepG2和Huh7肝癌细胞模型、慢病毒介导的Sh-TRIM7稳定转染的Huh7肝癌细胞系和基于CRISPR/Cas9系统的TRIM7基因敲除的Huh7肝癌细胞系及其相应的肝癌细胞对照组中,应用western blot检测TRIM7、Src的表达水平及mTORC1-S6K1信号通路分子的磷酸化水平。结果显示,抑制或敲除TRIM7后,Src的蛋白表达水平和mTORC1-S6K1信号通路分子的磷酸化水平显著上调。这表明抑制或敲除TRIM7能够显著提高Src的蛋白表达水平及mTORC1-S6K1信号通路的活化水平。6.2 TRIM7通过下调Src抑制mTORC1-S6K1倍号通路的活化在过表达TRIM7的Huh7肝癌细胞中,外源性过表达Src,应用western blot检测TRIM7、Src和p-Src(Tyr419)的水平及mTORC1-S6K1信号通路分子的磷酸化水平。结果显示,过表达Src能够显著逆转TRIM7对mTORC1-S6K1信号通路的抑制效应。在Huh7肝癌细胞中,分别转染Si-TRM7-1、Si-TRM7-2或Si-NC,用雷帕霉素抑制mTORC1信号通路的活性,应用western blot检测TRIM7的表达水平、mTORCI-S6K1信号通路分子的磷酸化水平及Src和p-Src(Tyr419)的水平。结果显示,雷帕霉素能够显著逆转TRIM7表达降低引起的mTORC1信号通路的活性增强,但不影响Src和p-Src(Tyr419)的水平。以上实验显示,mTORC1信号通路处于TRIM7介导的Src负向调控的下游,TRIM7显著抑制肝癌细胞中Src的表达与活化及其下游mTORC1-S6K1信号通路活化。这表明TRIM7通过下调Src抑制mTORC1-S6K1信号通路的活化,TRIM7能够抑制肝癌细胞中Src-mTORC1-S6K1信号轴的活性。6.3 TRIM7通过抑制Src-mTORC1-S6K1信号轴的活性发挥其抗肿瘤作用6.3.1 TRIM7通过负向调控Src发挥其抗肿瘤作用在过表达TRIM7的HepG2和Huh7肝癌细胞中,外源性过表达Src,应用western blot验证Flag-TRIM7和HA-Src的表达水平,应用CCK-8、Transwell和克隆形成实验分别检测肝癌细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力。实验结果显示,Src的外源性过表达显著逆转了 TRIM7对肝癌细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力的抑制效应。这表明TRIM7通过负向调控Src发挥其对肝癌的抑癌效应。6.3.2 TRIM7通过负向调控mTORC1-S6K1信号通路发挥其抗肿瘤作用在HepG2肝癌细胞中,分别转染Si-TRM7-1、Si-TRM7-2或Si-NC,用雷帕霉素抑制mTORC1信号通路的活性,应用western blot检测TRIM7的表达水平、mTORC1-S6K1信号通路分子的磷酸化水平及Src和p-Src(Tyr419)的水平,应用CCK-8、Transwell和克隆形成实验分别检测细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力。实验结果显示,雷帕霉素能够显著逆转TRIM7表达降低引起的mTORC1信号通路的活性增强,并有效地逆转TRIM7表达降低引起的肝癌细胞增殖、侵袭和克隆形成能力的增强。这表明,TRIM7通过抑制mTORC1-S6K1信号通路的活化发挥对肝癌的抑制效应。以上实验结果表明,TRIM7通过抑制Src-mTORC1-S6K1信号轴的活化发挥对肝癌的抑癌效应。7.TRIM7通过其功能性结构域抑制Src-mTORC1-S6K1信号轴发挥对肝癌的抑癌效应我们的研究显示,TRIM7通过其B30.2/SPRY结构域介导与Src蛋白的直接结合,通过其RING结构域介导Src发生K48位泛素化修饰。因此,RING结构域和B30.2/SPRY结构域是TRIM7发挥其功能的关键性结构域。7.1 TRIM7通过其功能性结构域抑制Src-mTORC1-S6K1信号轴在Huh7肝癌细胞中分别转染TRIM7功能域缺失的表达载体Flag-TRIM7△RING或Flag-TRIM7△B30.2/SPRY质粒,阳性对照组肝癌细胞转染野生型Flag-TRIM7质粒,阴性对照组肝癌细胞转染Flag-pENTER空载体质粒,应用western blot 验证 Flag-TRIM7、Flag-TRIM7 △ RING 和 Flag-TRIM7 △ B30.2/SPRY的表达水平,并检测Src-mTORC1-S6K1信号轴的活性。结果显示,缺失RING结构域或B30.2/SPRY结构域的TRIM7失去了对Src-mTORC1-S6K1信号轴的抑制效应。这说明TRIM7通过其RING结构域和B30.2/SPRY结构域抑制Src-mTORC1-S6K1信号轴的活化。7.2 TRIM7通过其功能性结构域发挥其抗肿瘤作用在HepG2和Huh7肝癌细胞中分别转染Flag-TRIM7 △ RING或Flag-TRIM7 A B30.2/SPRY质粒,阳性对照组肝癌细胞转染野生型Flag-TRIM7质粒,阴性对照组肝癌细胞转染Flag-pENTER空载体质粒,应用western blot验证Flag-TRIM7、Flag-TRIM7△RING 和 Flag-TRIM7△B30.2/SPRY 的表达水平,应用 CCK-8、Transwell和克隆形成实验分别检测肝癌细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力。实验结果显示,缺失RING结构域或B30.2/SPRY结构域的TRIM7失去了对肝癌细胞增殖、侵袭和克隆形成能力的抑制效应。这表明TRIM7通过其功能性结构域RING和B30.2/SPRY结构域发挥其对肝癌的抑癌效应。8.裸鼠肝癌异种移植瘤实验验证TRIM7对肝癌的抑癌效应和分子机制8.1 TRIM7外源性过表达的裸鼠肝癌异种移植瘤模型验证TRIM7对肝癌的抑癌效应和分子机制构建裸鼠肝癌异种移植瘤模型,将Flag-TRIM7质粒(30μg)注射在裸鼠一侧腋下形成的肿瘤瘤内,同时将Flag-pENTER空载体质粒(30μg)注射在另一侧腋下对照组瘤内,隔天注射一次,由此构建TRIM7外源性过表达的裸鼠肝癌异种移植瘤模型。裸鼠肿瘤的生长曲线显示,与对照组相比,TRIM7外源性过表达组的裸鼠瘤体生长受到显著抑制。肉眼可见的肿瘤形成17天后处死裸鼠,分离瘤体,结果显示,TRIM7外源性过表达组的裸鼠肿瘤显著小于对照组。对瘤体的大小与重量进行测量,结果显示,与对照组相比,TRIM7外源性过表达组的裸鼠瘤体的体积和重量显著降低。这表明外源性过表达TRIM7能够显著抑制裸鼠瘤体的生长,并降低裸鼠瘤体的体积与重量。将分离的裸鼠瘤体进行western blot检测,结果显示,与对照组相比,TRIM7外源性过表达组的裸鼠瘤体中TRIM7表达量显著提高,这表明TRIM7外源性过表达的裸鼠肝癌异种移植瘤模型构建成功。应用western blot检测裸鼠瘤体中Src-mTORC1-S6K1信号轴的相关分子的活化水平,结果显示,TRIM7外源性过表达组的裸鼠瘤体中Src-mTORC1-S6K1信号轴的活性受到显著抑制。这表明外源性过表达TRIM7能够显著抑制裸鼠肝癌异种移植瘤内Src-mTORC1-S6K1信号轴的活性。8.2 TRIM7稳定过表达的裸鼠肝癌异种移植瘤模型验证TRIM7对肝癌的抑癌效应和分子机制应用TRIM7稳定过表达的Huh7肝癌细胞系构建TRIM7稳定过表达的裸鼠肝癌异种移植瘤模型。裸鼠肿瘤的生长曲线显示,与对照组相比,TRIM7稳定过表达组的裸鼠瘤体生长受到显著抑制。肉眼可见的肿瘤形成21天后处死裸鼠,分离瘤体,结果显示TRIM7稳定过表达组的裸鼠瘤体显著小于对照组。测量裸鼠瘤体的大小与重量,结果显示,与对照组相比,TRIM7稳定过表达组的裸鼠肿瘤的体积和重量显著降低。这表明稳定过表达TRIM7能够显著抑制裸鼠瘤体的生长,并降低裸鼠瘤体的体积与重量。将分离的裸鼠瘤体进行western blot检测,结果显示,与对照组相比,TRIM7稳定过表达组的裸鼠瘤体中TRIM7表达量显著提高,这表明TRIM7稳定过表达的裸鼠肝癌异种移植瘤模型构建成功。应用western blot检测裸鼠瘤体中Src-mTORC1-S6K1信号轴的相关分子的活化水平,结果显示,TRIM7稳定过表达组的裸鼠肝癌异种移植瘤中Src-mTORC1-S6K1信号轴的活性受到显著抑制。这表明稳定过表达TRIM7能够显著抑制裸鼠瘤体中的Src-mTORC1-S6K1信号轴的活性。8.3 TRIM7敲除的裸鼠肝癌异种移植瘤模型验证TRIM7对肝癌的抑癌效应和分子机制应用基于CRISPR/Cas9体系建立的TRIM7敲除的Huh7肝癌细胞系构建TRIM7敲除的裸鼠异种移植瘤模型。裸鼠肿瘤生长曲线显示,与对照组相比,TRIM7敲除组的裸鼠瘤体生长显著加快。肉眼可见的肿瘤形成21天后处死裸鼠,分离瘤体,结果显示TRIM7敲除组的裸鼠瘤体显著大于对照组。测量并计算裸鼠瘤体的体积与重量,结果显示,与对照组相比,TRIM7敲除组裸鼠瘤体的体积和重量显著高于对照组。这表明敲除TRIM7能够显著加快裸鼠肿瘤的生长,并提高裸鼠瘤体的体积与重量。将分离的裸鼠瘤体进行western blot检测,结果显示,与对照组相比,TRIM7敲除组的TRIM7表达显著敲除,这表明TRIM7敲除的裸鼠肝癌异种移植瘤模型构建成功。应用western blot检测裸鼠瘤体中Src-mTORC1-S6K1信号轴的相关分子的活化水平,结果显示,TRIM7敲除组的裸鼠瘤体中Src-mTORC1-S6K1信号轴的活性显著增强。这表明敲除TRIM7能够显著活化裸鼠瘤体中的Src-mTORC1-S6K1信号轴。结论1.通过对肝癌临床标本、肝癌细胞模型与裸鼠肝癌异种移植瘤模型的研究,结果显示,TRIM7在肝癌中发挥抑癌效应,其在肝癌中的表达下调可能参与了肝癌的发生和进展。2.TRIM7的B30.2/SPRY结构域与Src的SH2结构域共同介导了二者的结合,TRIM7通过RING结构域介导Src发生K48位泛素化修饰,进而诱导其通过泛素-蛋白酶体途径发生降解。3.TRIM7通过抑制Src-mTORC1-S6K1信号轴的活化发挥对肝癌的抑癌效应。创新点及意义1.本课题首次证实了在临床肝癌组织中TRIM7的表达显著降低,进一步的研究提示TRIM7在肝癌组织中的低表达可能参与了肝癌的进展。这提示TRIM7可以作为一种潜在的肝癌进展和预后判定的生物标志物。2.TRIM7通过其B30.2/SPRY结构域与Src的SH2结构域发生结合,通过RING结构域介导Src发生K48位泛素化修饰,进而诱导其通过泛素-蛋白酶体途径降解,并进一步抑制其下游的mTORC1-S6K1信号通路,从而对肝癌的进展产生了显著的抑制效应,这为临床上研究肝癌新型治疗策略提供了实验和分子理论基础。