一、研究背景与目的软骨是人和脊椎动物特有的胚胎性骨骼,一种无血管组织。可分为透明软骨、弹性软骨和纤维软骨,为一种略带弹性的坚韧组织。软骨是由软骨细胞、纤维和软骨基质构成。在胎儿和年幼期,软骨组织分布较广,后来逐渐被骨组织代替。成年人软骨存在于骨的关节面、肋软骨、气管、耳廓、椎间盘等处。同时软骨的发生是胚胎发育的重要环节,软骨的正常发育最终生成了所有的长骨,它的正常发育不仅对形成正常形态和长度的骨骼极为重要,其发育对附着于其上的神经肌肉的正常发育也是至关重要。由于动物体内的长骨都是通过软骨内成骨过程而产生的,所以软骨内成骨的过程显得十分重要。长骨的发生会经过一系列的过程。首先是间充质细胞聚集然后分化出骨原细胞,后者分化出软骨细胞,软骨细胞不停的向四周分泌以Ⅱ型胶原为主的软骨基质,软骨细胞继而被包埋在软骨基质中,形成软骨组织即软骨雏形。软骨雏形中段外围首先出现骨质的形成,首先是软骨膜深层形成血管,其周边的骨原细胞分化成为成骨细胞,成骨细胞就开始生成并沉淀类骨质,自身因为被类骨质包埋而成为成骨细胞。软骨雏形中段外围首先出现骨质沉淀,形成骨领即最初的长骨皮质,软骨雏形中段随后出现血管的侵入,成骨细胞的分化以及破骨细胞的侵入,使得初级骨化中心得以形成；类似的是长骨两端也继而出现同样的生理过程,次级骨化中心最终得以出现。初级骨化中心和次级骨化中心之间的就是生长板。生长板中软骨细胞呈规律的柱状排列,分为静息期软骨细胞、增殖期软骨细胞、肥大期软骨细胞。肥大软骨细胞最终分化为终末肥大软骨细胞,其分泌的基质金属蛋白酶(MMPs)分解软骨基质,血管生长因子(VEGF)诱导血管的长入,带来成骨细胞和破骨细胞,最终在共同作用下生成新生骨质。而后天的长骨长度,很大程度上就取决于生长板中软骨细胞的规律增殖分化。调节生长板软骨细胞规律增殖分化的最重要通路是印猬蛋白-甲状旁腺激素相关肽(IHH-PTHrP)信号轴。生长板软骨细胞中,前肥大期软骨细胞分泌IHH,其直接作用于前肥大细胞周边的软骨膜,促使其中的软骨膜细胞向成骨细胞分化。同时,其作用于增殖期软骨细胞,直接促进其增殖,使得软骨柱延长。再者,IHH可以刺激静息期软骨细胞分泌PTHrP, PTHrP作用于增殖期软骨细胞及前肥大软骨细胞,抑制其向肥大软骨细胞分化,保持增殖状态。因而在生长板中IHH-PTHrP分子的共同作用下,软骨细胞得以有规律的增殖、分化。mTOR是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(the mechanistic target of rapamycin, mTOR)是整合细胞内外各种信号调节细胞生长与代谢的中心信号分子。其mTOR复合物1(mTORCl)通路的活性也是调节细胞生长、代谢、增殖、凋亡的重要因素。软骨组织作为区别于其他组织的独立组织,其发生、发育过程是在一个在低氧的状态下间充质细胞向软骨细胞分化、增殖、分化的生理过程。生长板的软骨细胞处在一个低营养,低血氧浓度的状态,它们是如何在这样的情况下分泌胶原、增殖分化,完成相关的生理功能的尚有待研究。近年来,针对软骨细胞增殖、分化的调控机制研究发现：软骨增殖分化过程与Wnt, mTOR等多条细胞分子信号通路相关。近年来已有若干研究将焦点聚集在mTOR信号通路调控软骨细胞增殖分化的机制上,并发现mTOR特异性抑制剂,能抑制软骨细胞的增殖与分化。亦有研究证实雷帕霉素能够抑制接受治疗的幼儿长骨的生长发育。有报道称mTOR通路活性在软骨发育中出现了改变。但是目前多项研究尚不深入,mTOR扮演着何种调控角色尚不明确,mTOR调控软骨生长发育的时间点及其效应如何尚未见报道。而mTOR通路是如何影响软骨细胞的规律增殖分化进而影响了长骨的生长尚有待研究。二、目的本课题主要研究了以下内容：1、软骨细胞增殖分化过程中mTORC1通路活性的变化。2、雷帕霉素对软骨细胞增殖分化的影响。3、软骨细胞mTORC1通路过度活化对于小鼠软骨内成骨的影响。4、mTORC1通路如何调控PTHrP来控制软骨细胞增殖分化。三、材料方法1、体内软骨细胞增殖分化时mTORC1通路活性的变化情况。利用免疫荧光观察mTORC1通路活性指标蛋白磷酸化核糖体S6蛋白(pS6)在小鼠E14.5天肱骨,以及P7、P18天胫骨中的表达情况。利用Western blots来分析培养的原代软骨细胞在诱导分化的过程中pS6蛋白的变化情况。利用免疫荧光观察mTORC1上游抑制蛋白TSC1来研究mTORC1通路活性变化情况。2、雷帕霉素对软骨细胞增殖分化的影响。绘制不同浓度雷帕霉素处理过后的软骨细胞的增殖曲线。雷帕霉素处理过后原代软骨细胞,通过qPCR来分析软骨分化相关指标Co110al、MMP13、IHH mRNA的变化情况。给予孕鼠腹腔注射雷帕霉素三天后,取材观察P0天小鼠的胫骨发育情况,分析切片的苏木素-伊红染色(HE染色)、pS6的免疫荧光、MMP13的原位杂交,来分析雷帕霉素是如何对软骨细胞分化造成影响。具体分析HE切片上显示的增殖区,肥大区长度来判断雷帕霉素是如何影响到增殖和肥大进程的。3、软骨细胞过度激活的mTORC1通路的软骨细胞特异性TSC1敲除小鼠的软骨细胞增殖、分化情况。利用Cre-Loxp系统,我们构建出软骨细胞特异性敲除TSC1基因的小鼠(TSC1CKO)。通过western blots分析TSC1CKO小鼠软骨细胞mTORC1通路激活情况。通过免疫荧光分析P0天TSC1CKO小鼠和对照小鼠肱骨的pS6变化情况。测量TSC1CKO小鼠和TSC1flox/flox小鼠的身长的差异以及肱骨、股骨、胫骨的差异。分析P0、2W、4W、8W、12W小鼠胫骨切片HE染色的组织学差异。4、过度激活的mTORC1通路的TSC1CKO小鼠软骨细胞增殖情况。TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠肋骨切片的HE染色。给予P0天TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠注射BrdU,2h后取材并切片行BrdU免疫荧光,观察TSC1基因敲除对于小鼠软骨增殖的影响。取TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠的胫骨及肋软骨,研磨后提取蛋白,行western blots分析增殖相关的细胞周期蛋白B1(CyclinB1)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、核增殖抗原PCNA的变化。利用免疫组织化学来分析Cyclin B1在TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠胫骨的表达情况。使用CCK8细胞增殖检测试剂盒来检测TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠软骨原代细胞的增殖情况。5、TSC1CKO小鼠表现出肥大分化减慢,终末肥大分化受到抑制。利用原位杂交显示Col10al的mRNA在TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠胫骨生长板上的表达情况。HE切片分析TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠胫骨生长板的肥大分化情况。利用BrdU Chase实验追踪增殖期软骨细胞肥大分化情况。利用western blots分析4周龄TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠的肥大分化相关蛋白Runx2、sterix、Col2al、Col10al,细胞周期相关蛋白p21KIP1、p27KIP1、 p57KIP2,以及终末肥大分化相关蛋白MMP13、OPN的表达。取E18.5的小鼠胫骨,行冰冻切片Von Kossa染色,观察TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠的终末肥大软骨细胞的数量及成骨情况。6、雷帕霉素可以逆转TSC1CKO小鼠的表型。于出生后第3周开始给予TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠灌服雷帕霉素,绘制其生存曲线,观察雷帕霉素对TSC1CKO、鼠死亡率的影响。取12周龄TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠,行茜素红-阿尔新蓝染色,观察小鼠的骨骼发育情况及骨化情况。对4周龄的TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠给予2周雷帕霉素处理后,切片行HE染色观察其胫骨生长板增殖区及肥大区的变化。取TSC1CKO小鼠,TSC1flox/flox小鼠及雷帕霉素处理过后的TSC1CKO小鼠胫骨生长板组织,利用Western blots分析雷帕霉素对细胞周期蛋白以及增殖蛋白例如PCNA、Cyclin D1,肥大分化相关蛋白及终末分化相关蛋白例如Col2al、Coll0al、Runx2、Osterix、MMP13、OPN的影响。7、TSC1CKO小鼠出现相关表型的机制研究。利用qPCR分析TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠胫骨生长板的IHH, PTHrP、Gli1、Patched1的mRNA表达水平。利用western blots分析TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠的生长板组织,研究IHH-PTHrP轴中相关蛋白的变化情况。利用免疫组织化学分析PTHrP在TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠胫骨生长板的表达情况。利用免疫组织化学分析接受了雷帕霉素一周后,PTHrP在P14天的TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠胫骨生长板的表达情况。给予雷帕霉素处理过后,利用western blots检测TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠胫骨生长板组织的PTHrP、Gli1、Patched1蛋白表达情况。转染Gli2质粒或者Gli2突变体S234E或者siRNA后观察PTHrP的变化情况,以及经过雷帕霉素处理过后的情况。给予IGF-1模拟生理性mTORC1激活后,观察雷帕霉素处理对软骨细胞Patchedl、Gli1、PTHrP的影响。转染核糖体S6激酶1(S6K1)过表达质粒,利用荧光素酶实验(luciferase assay)观察S6K1对PTHrP及Patchedl表达的影响。给予培养的TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox软骨细胞Patchedl抑制剂GDC-0449及Gli1/2抑制剂GANT-61,观察其对细胞增殖的影响。给予培养的TSC1CKO小鼠软骨细胞GDC-0449及雷帕霉素,提取蛋白,检测Gli1、PTHrP、 Patchedl蛋白的变化。利用染色质免疫共沉淀(CHIP)实验,检测Gli2与PTHrP的相互作用在TSC1CKO小鼠软骨细胞的变化情况。8、mTORC1通路下游蛋白S6K1与Gli2相互作用的研究。利用免疫共沉淀方法,检测S6K1和Gli2、Gli1的相互作用。利用免疫共沉淀办法,检测TSC1CKO及TSC1flox/flox小鼠中磷酸化Gli2即p-Gli2的情况,以及雷帕霉素对其的影响。提取TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠软骨细胞以及经过雷帕霉素处理的软骨细胞的细胞核、细胞质组分,Western Blots检测Gli1、 Gli2、SuFu蛋白的核浆分布情况。转染S6K1过表达质粒至小鼠成软骨细胞即ATDC5细胞给予雷帕霉素处理后,提取其细胞核、细胞质组分,Western Blots检测Gli1、Gli2、SuFu蛋白的核浆分布情况。给予ATDC5细胞胰岛素样生长因子1(IGF-1因子)处理,模拟体内生理刺激后,给予雷帕霉素处理,提取其细胞核、细胞质组分,Western Blots检测Gli1、Gli2、SuFu蛋白的核浆分布情况。利用免疫共沉淀,检测TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠软骨细胞内SuFu与Gli1、Gli2的相互作用情况。将Gli2质粒、Gli2突变体激活型S234E质粒以及Gli2突变体抑制型S234A质粒转染ATDC5细胞,利用免疫共沉淀,检测以上处理对Gli2与SuFu相互作用的影响。将Gli2质粒、Gli2突变体激活型S234E质粒以及Gli2突变体抑制型S234A质粒转染ATDC5细胞,提取蛋白,使用Western blots检测PTHrP、Gli1、Gli2蛋白表达情况。将S6K1过表达质粒转染ATDC5细胞,提取蛋白,Western blots检测PTHrP、Gli1、Gli2蛋白表达情况。将培养的TSC1CKO小鼠及TSC1flox/flox小鼠软骨细胞给予雷帕霉素处理,行免疫荧光,观察PTHrP在其中的表达情况以及Gli2在其中的核浆分布情况。四、结果1、软骨分化过程中mTORCl通路活性发生变化。通过E14.5天的小鼠肱骨切片免疫荧光染色,我们发现mTORC1通路活性标志pS6蛋白在增殖区(PZ)及前肥大区(PHZ)表达最高,而在肥大区(HZ)基本缺失。同样的现象,在出生后的小鼠即P7天、P18天的小鼠胫骨切片上得到证实。普通软骨培养基以及ITS软骨诱导培养基的原代软骨细胞,ITS诱导培养基能够诱导原代软骨向肥大软骨细胞分化,随着分化的进行,其表达的TSC1逐渐增多,而pS6表达逐渐减少。体内外实验证明随着软骨分化的进行,增殖区及前肥大区软骨细胞有高的mTORC1活性,而肥大区软骨细胞mTORC1活性较低。qPCR也证实了ITS培养基的原代软骨细胞肥大分化增多,出现终末肥大分化的标志蛋白MMP13。同时,免疫荧光染色也显示了mTORC1活性的变化是由于分化过程中TSC1蛋白的变化所导致的。2、抑制mTORC1活性可以促进软骨细胞终末分化10nnM浓度的雷帕霉素可以抑制软骨细胞增殖。qPCR显示雷帕霉素处理可以促进软骨细胞退出增殖周期,进入肥大分化及终末分化,表现为分化相关的IHH, Co110al的mRNA表达增高以及终末分化指标的MMPl3的mRNA表达增高。HE切片分析显示,给予雷帕霉素后,增殖区缩短。原位杂交显示给予雷帕霉素后,小鼠胫骨生长板的MMP13表达增多。Western blots也证实雷帕霉素处理后MMP13表达增多。3、软骨细胞内过度激活的mTORC1通路会导致小鼠软骨发育不良。构建出的TSC1CKO小鼠表现出软骨细胞内TSC1表达缺失,pS6表达显著增高。免疫荧光显示,TSC1flox/flox小鼠肱骨高表达的pS6蛋白局限于增殖区PZ、前肥大区PHZ,肥大区HZ pS6蛋白缺失,静息区RZ有较低的pS6活性；TSC1CKO小鼠肱骨的pS6蛋白在静息区RZ、增殖区PZ、前肥大区PHZ、肥大区HZ都有高表达。结果显示TSC1CKO小鼠的所有时期的软骨细胞都有强的mTORC1活性。大体照片显示TSC1CKO小鼠的体长以及肱骨、胫骨、股骨长度均小于TSC1flox/flox小鼠。HE切片分析显示,出生P0天TSC1CKO小鼠的胫骨肥大区软骨高度明显短与同窝对照。出生2W后TSC1CKO小鼠肥大区高度和同窝对照基本一致,4W、8W、12W的TSC1CKO、鼠,其胫骨肥大区高度都明显多于同窝对照小鼠。4、过度激活的mTORCl通路使TSC1CKO小鼠软骨细胞增殖增加。HE切片分析显示,TSC1CKO小鼠的肋软骨细胞中有更多的处在分裂相的软骨细胞。BrdU免疫荧光显示,TSC1CKO小鼠的胫骨静息区、增殖区软骨细胞中的BrdU阳性细胞都明显多于TSC1flox/flox小鼠,同时在TSC1CKO小鼠的肥大期软骨中,也发现有BrdU阳性细胞。结果说明TSC1CKO小鼠的软骨细胞增殖增加,甚至在本应退出细胞周期的肥大软骨细胞中也发现了增殖现象。Western blots显示TSC1CKO软骨细胞的PCNA、Cyclin D1、Cyclin B1表达增高。免疫组织化学显示,Cyclin B1表达水平增高,在肥大期软骨内也发现有Cyclin B1高表达。软骨细胞的增殖曲线显示,TSC1CKO的软骨细胞增殖增加。5、过度激活的mTORC1通路抑制软骨细胞的成熟分化。原位杂交显示4周龄的TSC1CKO小鼠的Col10al的表达区域高度明显高于同窝对照。Western blots结果显示TSC1CKO小鼠的肥大分化相关基因Runx2、 Col10al、Osterix、p21KIP1、p27KIP1、p57KIP2均表达降低,而终末分化相关基因OPN、MMP13表达亦是降低。BrdU chase assay显示,TSC1CKO小鼠的增殖期软骨细胞向肥大分化速度变慢。免疫组化显示TSC1CKO小鼠胫骨生长板的p57KIP2表达水平较同窝对照低。冰冻切片的Von Kossa显示TSC1CKO小鼠的终末肥大软骨细胞减少。6、雷帕霉素可以抑制TSC1敲除小鼠的软骨发育不良表型的发生。给予雷帕霉素灌胃后,TSC1CKO小鼠的死亡率减少。骨架染色显示TSC1CKO小鼠的体型较小,肋软骨不能骨化,给予雷帕霉素灌胃的TSC1CKO小鼠肋软骨开始骨化。HE切片分析显示,TSC1CKO小鼠的肥大期软骨区高度较大,给予雷帕霉素后,TSC1CKO小鼠的肥大期软骨区变窄。Western blots显示,TSC1CKO小鼠细胞增殖相关蛋白Cyclin D1、PCNA增加,而分化相关的蛋白Col10al、Runx2、MMP13、OPN表达均降低。7、mTORC1通路的活性是PTHrP的分泌过程所需要的。qPCR显示,TSC1CKO小鼠软骨组织IHH mRNA表达同对照组没有差异,而PTHrP、Gli1、Patched1表达均较对照组明显升高。Western blots显示Gli1、 PTHrP、Patchedl表达量增高明显,而且雷帕霉素可以降低这些蛋白的表达。免疫组化显示,TSC1CKO小鼠软骨组织中PTHrP表达明显升高,且给予雷帕霉素后,PTHrP表达降低。20nnM浓度的雷帕霉素能够抑制TSC1CKO小鼠软骨细胞的增殖。转染Gli2、S234E质粒以及给予雷帕霉素处理后,Western blots显示Gli2及其激活型突变S234E可以增强PTHrP蛋白表达水平。给予IGF-1因子模拟生理性刺激显示PTHrP、Gli1、Patched1蛋白表达水平均明显增加。Luciferase assay显示过表达S6K1可以增加PTHrP及Patchedl的表达,而给予雷帕霉素可以抑制S6K1的效应；过表达S6K1+Gli2可以增加PTHrP表达,而同时转染Gli2siRNA可以抵消这种效应。给予TSC1flox/flox小鼠软骨细胞GDC-0449以及GANT-61,两者均可抑制其增殖；而在TSC1CKO小鼠软骨细胞上,GDC-0449不能抑制其增殖。Western blots显示相比GDC-0449,雷帕霉素仍可抑制Gli1、 PTHrP.Patchedl的表达.CHIP实验证明,Gli2和PTHrP启动子的结合,TSC1CKO小鼠软骨细胞中增强,而雷帕霉素可以抑制这种效应。8、mTORC1/S6K1通路通过影响Gli2来调控PTHrP分泌。免疫共沉淀显示,S6K1同Gli1及Gli2有相互作用,而这种作用在TSC1CKO小鼠软骨细胞中增强,同时雷帕霉素可以抑制S6K1同Gli1及Gli2的结合。另一项免疫共沉淀显示,磷酸化的Gli2在TSC1CKO小鼠软骨细胞中增多,而雷帕霉素可以抑制Gli2的磷酸化。Western blots显示Gli1、Gli2在TSC1CKO小鼠软骨细胞中,更多比例的分布在细胞核,表明TSC1CKO小鼠的Gli1、Gli2入核增多,而雷帕霉素亦可以阻止其入核；转染S6K1的ATDC5细胞以及给予IGF-1因子刺激的相关实验也证实此现象。同时我们看到,免疫共沉淀显示SuFu与Gli1、Gli2的结合在TSC1CKO上减少,表明TSC1敲除影响了SuFu和Gli1、 Gli2的结合。转染Gli2、S234A、S234E的相关实验证明,磷酸化位点的有无对于SuFu和Gli2的结合有影响。转染Gli2、S234A、S234E质粒的实验显示,激活型S234E能够增强PTHrP及Gli1表达,而S234A可以一定程度上抑制PTHrP及Gii1表达。转染S6K1过表达质粒的实验证明PTHrP、Gli1的表达均上升。免疫荧光也证实TSC1CKO小鼠软骨细胞的PTHrP增多,而雷帕霉素可以抑制其表达。免疫荧光实验也观察到,TSC1CKO小鼠软骨细胞的Gli2入核增多。五、结论本文利用基因敲除小鼠与细胞模型,探讨了TSC1/mTORC1/S6K1信号通路在软骨发生中的作用及PTHrP分泌调控机制,得出以下主要结论：1、软骨细胞规律的增殖肥大分化过程中,伴随着mTORC1通路活性的变化：静息期软骨细胞维持一定的mTORCl活性,增殖期及前肥大期软骨细胞mTORC1活性增高,随后分化进行时肥大期软骨细胞mTORC1活性缺失。2、mTORC1抑制剂雷帕霉素可以促进软骨细胞肥大分化,特别是终末肥大分化。3、软骨细胞内过度激活的mTORC1使得小鼠出现侏儒表型。主要原因是,软骨细胞增殖增加,肥大分化减少,终末肥大分化延迟,成骨延迟。而雷帕霉素可以一定程度上逆转这个现象。4、过度激活的mTORC1通路主要通过调控PTHrP来影响软骨细胞规律分化。激活的mTORC1导致PTHrP表达增多。增多的PTHrP使得肥大分化变慢,终末肥大分化及成骨延迟。5、过度激活的mTORC1通路是通过S6K1和Gli2的相互作用使PTHrP表达增多。S6K1使Gli2的S234位点磷酸化增多,抑制SuFu同Gli2的结合,从而使得Gli2入核增多,使得PTHrP表达增多。至此,本研究不仅证明mTORC1通路活性是伴随软骨细胞增殖分化而变化的,而且证明了适当的、精确调控的mTORC1通路活性对于软骨细胞正常的增殖分化来说是至关重要的。而且我们阐明了mTORC1是如何调控PTHrP分泌来控制软骨细胞的规律分化这一新机制。本研究为了解软骨细胞发育分化提供新的观点,为临床上各类软骨发育不良及各类侏儒症的诊治提供了新的思路。