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本文围绕以纤维二糖为底物合成海藻糖的可行性展开研究。以大肠杆菌为宿主细胞,利用多质粒表达系统构建了纤维二糖至海藻糖的合成途径,对影响海藻糖合成的关键因素进行了探讨,最后在此基础上建立了一种与TCA循环相偶联的能量再生体系,提高海藻糖产量和转化率。主要研究结果如下:(1)本论文克隆了来源于施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501的6-磷酸海藻糖合成酶(OtsA)和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(OtsB),构建了合成海藻糖的OtsAB途径,将该途径外源导入E.coli BL21(DE3)中,得到了重组菌株E.coli BL01。以葡萄糖为底物,E.coli BL01通过全细胞催化合成了海藻糖,9 h后海藻糖产量为0.25 g/L。(2)葡萄糖是纤维二糖水解后的产物,该水解过程需要昂贵的商品化β-葡萄糖苷酶。因此,开发利用纤维二糖的微生物生产海藻糖可以缓解这些问题。在E.coli BL01基础上,通过克隆来自E.coli BL21的UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因galU和来自天然纤维素分解细菌Saccharophagus degradans的纤维二糖磷酸化酶基因cepA,构建了E.coli BL05。E.coli BL05可实现纤维二糖至海藻糖的生物转化,通过全细胞催化的方式,以20 g/L的纤维二糖为底物合成海藻糖时,添加10 mM井冈霉素,36 h后海藻糖的产量最高,大约为1.3 g/L。同时考察了井冈霉素、温度和碘乙酸对海藻糖产量的影响。结果表明,添加10 mM井冈霉素可显著抑制海藻糖降解从而提高海藻糖产量;提高温度和添加碘乙酸对提高海藻糖产量没有助力。(3)底物和能量的供应、海藻糖的降解、其他代谢支路的分流等因素都会影响海藻糖的产量。为了克服上述限制因素,提高纤维二糖至海藻糖转化率,本研究在E.coli YW-3的基础上敲除了zwf和pgi基因构建了E.coli ZL-1A,该菌株异源表达了以葡萄糖-1-磷酸为底物合成GDP-葡萄糖的GDP甘露糖焦磷酸化酶基因gmppb及以葡萄糖-6-磷酸和GDP-葡萄糖为底物合成海藻糖-6-磷酸的海藻糖-6-磷酸化酶基因otsA,实现了纤维二糖向海藻糖的转化。同时考察了柠檬酸三钠对驱动海藻糖合成的影响,当添加10 g/L柠檬酸三钠时,以E.coli YW-3A为出发菌株得到的海藻糖产量最高为0.41 g/L,比不添加的提高了10倍左右;以E.coli ZL-1A为出发菌株添加10 g/L柠檬酸三钠时的海藻糖产量为0.12 g/L,比不添加的提高了6倍左右。