近几年来,中医药在治疗缺血性中风方面越来越显现其独特的优势。补阳还五汤是清代名医王清任创立的益气活血名方,方中重用君药黄芪以达行气活血之功,是治疗中风后遗症的传世验方。本研究采用补阳还五汤君药黄芪中脑微血管内皮细胞和神经元样PC12细胞膜效应成分,运用CCK-8、免疫荧光和Western Blot技术,利用氧糖剥夺再灌注模型的脑微血管内皮细胞(rat brain microvascular endothelial cells,rBMECs)和神经元样PC12细胞,验证效应成分的药效。从MLCP/MLC通路、GAP-43及BDNF角度出发探讨这些成分对脑微血管内皮细胞和神经元样PC12细胞氧糖剥夺损伤的保护作用及对模型细胞的“生新”作用,探究补阳还五汤在促进脑缺血再灌注损伤后血管及神经元康复“生新”的药效物质基础,为建立药物制剂新标准提供依据。目的:从MLCP/MLC通路及VEGF表达方向研究补阳还五汤中黄芪脑微血管内皮细胞膜和神经元样PC12细胞膜效应成分在脑微血管内皮细胞氧糖剥夺再灌注损伤中的作用,从GAP-43及BDNF角度出发研究这些成分对神经元样PC12细胞氧糖剥夺再灌注损伤的保护作用,探讨补阳还五汤中黄芪效应成分对氧糖剥夺再灌注损伤后血管及神经元“生新”的作用机制。方法:1.原代脑微血管内皮细胞的分离鉴定参考文献方法[1-2],从10日龄大鼠脑组织中分离获得原代脑微血管内皮细胞,培养传代,观察细胞形态,免疫荧光染色法检查细胞纯度。2.效应成分对氧糖剥夺再灌注脑微血管内皮细胞活性的影响运用氧糖剥夺再灌注模型的脑微血管内皮细胞,利用CCK8试剂检测吸光度,对效应成分进行初步药效探索研究。3.效应成分对氧糖剥夺再灌注模型脑微血管内皮细胞MLC、p-MLC和VEGF表达的影响采用Western Blot法考察效应成分对rBMECs氧糖剥夺再灌注模型细胞MLC、p-MLC和VEGF表达的影响,探讨效应成分促进血管新生的作用机制。4.神经元样PC12细胞的培养与鉴定利用神经生长因子共培养技术及免疫荧光鉴定技术,诱导未分化PC12细胞分化成具有神经元样PC12细胞,观察细胞形态,检查细胞阳性率。5.效应成分对氧糖剥夺神经元样PC 12细胞活性的影响运用氧糖剥夺再灌注模型的神经元样PC12细胞,利用CCK8试剂检测吸光度,对效应成分进行初步药效探索研究。6.效应成分对氧糖剥夺模型神经元样PC12细胞GAP-43和BDNF表达的影响采用Western Blot法考察效应成分对神经元样PC 12氧糖剥夺模型细胞GAP-43和BDNF表达的影响,探讨效应成分对神经细胞的“生新”作用机制。结果:1.原代脑微血管内皮细胞的分离鉴定分离的原代脑微血管内皮细胞细胞在倒置显微镜下呈长梭型,细胞融合后呈现明显的“漩涡”状及内皮细胞典型的“铺路石”特征。免疫荧光染色鉴定纯度达95%以上。2.效应成分对氧糖剥夺脑微血管内皮细胞活力的影响CCK-8实验结果显示,毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷在合适的浓度范围内对氧糖剥夺损伤脑微血管内皮细胞活性均具有不同程度的增强作用,提示两成分对脑微血管内皮氧糖剥夺模型细胞具有保护作用,可进一步探讨其分子作用机制。3.效应成分对氧糖剥夺模型细胞MLC、p-MLC和VEGF表达的影响两效应成分均能不同程度下调p-MLC水平,上调MLC和VEGF的水平,提示下调p-MLC上调MLC和VEGF分泌水平可能是两效应成分发挥促进氧糖剥夺再灌注模型脑微血管内皮细胞“生新”作用机制之一。4.神经元样PC12细胞的培养与鉴定利用神经生长因子共培养技术及免疫荧光鉴定技术,100ng/mL神经生长因子诱导未分化PC12细胞4d,即可分化未分化PC12细胞成具有神经元样PC12细胞,阳性率达90%以上。5.效应成分对氧糖剥夺神经元样PC 12细胞活性的影响CCK8实验结果显示,毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷在合适的浓度范围内对氧糖剥夺损伤神经元样PC12细胞活性均具有不同程度的增强作用,表现为促进神经元存活作用。6.效应成分对氧糖剥夺模型神经元样PC12细胞GAP-43和BDNF表达的影响两效应成分均能不同程度上调GAP-43和BDNF表达的水平,提示促进GAP-43和BDNF的表达可能是两效应成分发挥促进氧糖剥夺再灌注模型神经元样PC12细胞“生新”作用机制之一。结论:自提的大鼠脑微血管内皮细胞和诱导分化的神经元样PC12细胞符合实验要求,可用于细胞活力验证实验和Western Blot实验;效应成分可提高脑微血管内皮细胞和神经元样PC12细胞在氧糖剥夺再灌注条件下的存活率;效应成分可能通过上调氧糖剥夺模型脑微血管内皮细胞MLC、VEGF的水平和下调p-MLC水平,发挥促进血管“生新”作用,通过上调氧糖剥夺模型PC12细胞GAP-43和BDNF的水平发挥促进神经元“生新”作用。