原创药物的研制得益于新靶标的发现,而新靶标蛋白的发现依赖于高可信度、高通量的药物-蛋白质相互作用分析方法。蛋白质作为生命功能的执行者,其表达量、空间定位与结构差异直接影响药效的发挥。目前,超过85%的蛋白尚被认为是无法成药的,主要原因是缺少药物分子靶向的空腔以及相应的反应活性位点。因此,基于蛋白质组学层次实现对氨基酸反应活性位点的表征成为原创药物设计的关键。基于活性的蛋白质组分析（Activity-based protein profiling,ABPP）策略是结合化学探针的标记和质谱定量技术实现相互作用靶蛋白的鉴定,其已广泛应用于半胱氨酸、赖氨酸等反应活性位点的探测。组氨酸占据超过1/5的人源蛋白酶活性中心,然而对其位点活性探测技术尚处于起步阶段,主要原因是组氨酸具有弱亲核性,难以实现生理条件下的全局性标记。本论文中,基于α,β-不饱和烯醛试剂的强亲电性,筛选并获得了具有高效组氨酸标记效率的丙烯醛（ACR）探针;在此基础上,发展了基于ACR浓度依赖的组氨酸标记技术,并利用醛基作为富集标签,建立了基于可逆酰肼化学的标记肽段富集技术,实现了标记位点层次的高效富集与鉴定;进而,利用以上技术实现了He La细胞中3187个蛋白质的8221个组氨酸位点反应活性表征,并筛选获得了其中的301个高反应组氨酸位点,为后续基于组氨酸的共价靶向偶联药物的开发提供了数据支持,具体研究内容如下:（1）建立了基于α,β-不饱和烯醛试剂的组氨酸标记策略,利用烯醛探针的双功能性:烯基与组氨酸侧链咪唑基发生迈克尔加成反应,生理条件下实现了组氨酸的标记;醛基与酰肼基团可逆反应,实现了标记蛋白/肽段的富集。本文共筛选了8种具有不同取代基的α,β-不饱和烯醛试剂,并获得了具有组氨酸高标记活性的ACR探针,实现了超过1563个组氨酸反应活性位点的鉴定;（2）针对ACR探针与半胱氨酸等氨基酸的副反应,发展了基于N-乙基马来酰亚胺封闭的标记策略,有效克服了半胱氨酸等残基对标记和富集过程的干扰,将探针对组氨酸残基的标记特异性从30%提高到90%,并且将组氨酸的鉴定数目提高到4000个以上,实现了生理条件下组氨酸位点的高覆盖度标记与鉴定;（3）建立了基于ACR浓度依赖的组氨酸反应活性定量表征技术,分别用高（500μM）、低（50μM）浓度剂量的ACR标记组氨酸残基,并通过肽段可逆释放过程引入同位素标记,实现了8221个组氨酸位点反应活性的定量。进一步的分析中,共筛选出2947个低反应性组氨酸残基,450个中反应性组氨酸残基,301个高反应性组氨酸残基。结果分析发现,其组氨酸的反应活性与磷酸化的占有率呈负相关,其进一步机制研究尚在进行中。此外,针对糖酵解过程的关键蛋白酶ALDOA进行分析,发现其高反应活性的His362位点对于酶活选择性至关重要,并进行了相关结构模拟与验证,为ALODOA靶向药物的研发提供指导。