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目的通过以pIRES质粒为载体构建可同时独立表达Ag85A和ESAT6两种抗原的抗结核二价DNA疫苗,并经体外实验评价其免疫原性及免疫效应,为新型结核疫苗的研发提供新的思路和实验基础。方法1.根据GenBank报道的目的基因(Ag85A和ESAT6基因)全长序列和pIRES质粒酶切位点的特点,利用DNAClub及Premier Primer5软件设计特异性引物。以结核杆菌标准株H37Rv的DNA为模版,经PCR扩增Ag85A和ESAT6基因,分别用限制性内切酶Nhe Ⅰ、EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ、Eag Ⅰ对扩增产物和pIRES空质粒双酶切,经连接酶连接,构建pIRES-Ag85A-ESAT6重组质粒,并经菌液PCR、质粒双酶切和质粒测序鉴定。2. pIRES-Ag85A-ESAT6重组质粒鉴定构建成功后,转入DH5a菌株,筛选重组质粒,并用质粒小提试剂盒分离纯化质粒DNA。3.将重组质粒采用脂质体法转染至RAW264.7细胞,于5%CO2培养箱中,37℃,培养24-48h后,western blot法检测质粒蛋白表达情况。4.大量提取重组质粒,经三次肌肉注射质粒免疫BALB/c小鼠,每次间隔2w,末次免疫2w后,取小鼠血清,用ELISA法检测血清中抗Ag85A抗体和抗ESAT6抗体情况。5.同时无菌取小鼠脾细胞在Ag85A和ESAT6蛋白刺激下培养,用ELISA法检测培养液中细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4)分泌情况。结果1.成功构建pIRES-Ag85A-ESAT6重组质粒,经PCR鉴定、质粒双酶切,DNA凝胶电泳后,分别出现1017bp和288bp的条带,与Ag85A和ESAT6的理论值相符,并经测序进一步鉴定构建成功。2.分别将用三种浓度的pIRES-Ag85A-ESAT6重组质粒转染至RAW264.7细胞后,经western blot鉴定证实了Ag85A和ESAT6两种蛋白可在细胞内成功表达,且表达水平与转染剂量存在正相关。3. ELISA法检测免疫小鼠血清中抗Ag85A抗体和抗ESAT6抗体变化情况,发现转染了pIRES-Ag85A-ESAT6质粒的二价疫苗组,相应的抗Ag85A抗体和抗ESAT6抗体明显升高,(P<0.05),且IgG2a抗体升高明显。4.在细胞因子检测中,pIRES-Ag85A-ESAT6质粒组的IFN-γ、IL-2水平显著升高(P<0.05),而IL-4的值均较低,组间无显著差异性。结论1. pIRES-Ag85A-ESAT6DNA疫苗,能够在真核细胞中独立表达Ag85A和ESAT6两种抗原。2. pIRES-Ag85A-ESAT6DNA疫苗可诱导小鼠强烈的特异性免疫应答,且以Th1优势免疫应答为主。3. pIRES-Ag85A-ESAT6DNA疫苗较单一Ag85A或ESAT6疫苗特异性免疫应答强。