丙型肝炎病毒(HCV)所致的丙型肝炎(HC)是一种危害严重的传染病,HCV感染呈世界性分布,中国是HCV的高流行区,在中国大约有3-4千万名HCV感染者。HCV感染后80%形成慢性感染,并且最终有约20%-35%的感染者引起肝硬化、肝癌等肝病。目前尚无有效的疫苗能够预防HCV感染和特效的治疗药物,所以对相关高危人群(献血员、静脉吸毒者、血液透析者等)进行筛选和早期检测是控制HC发生和传播的重要手段。HCV的抗体检测是诊断HCV慢性感染和进行献血员筛查的主要方法。最早的第一代HCV抗体检测试剂所用的重组抗原c100-3只来源于HCV基因组的非结构区NS4,它的特异性和敏感性均欠缺,但是随着检测试剂中先后加入了来自结构区C、非结构区NS3的重组抗原(第二代检测试剂)以及NS5区重组抗原(第三代检测试剂),HCV抗体检测试剂的特异性和敏感性都得到很大提高,从而对献血员的筛查更为有效。尽管对献血员的筛查已经减少了输血后肝炎发生率,但仍有部分受血者发生输血后肝炎;另外,目前的检测试剂在低危人群中的筛查还会出现假阳性的结果,所以HCV抗体检测试剂仍然不够完善。HCV的基因组高度异质性,不同基因型之间的全序列比较有33%的变异。HCV至少能分为6个基因型,每个基因型又包含多个基因亚型。HCV基因组序列的变异和基因组编码蛋白抗原性、生物学性质的变异相关,这对于HCV的血清学和病毒学检测有重要影响。目前的商业化检测试剂所用的抗原蛋白/人工合成肽均来源于基因型1,对于非1型HCV抗体的检测可能有所影响。本研究中我们构建了分别含有HCV不同基因型不同编码区片段基因的重组质粒,分别表达纯化了相应的目的蛋白,旨在探讨不同编码区不同基因序列对重组蛋白抗原反应性的影响以及在HCV抗体检测中的意义。本研究分为三部分:HCV不同基因型不同区域重组质粒的构建、蛋白表达及纯化分别从含有HCV各片段基因的质粒上以PCR扩增出位于HCV C、NS3(1型)、NS3(6型)和NS5区的基因片段;双酶切后插入pET-28a-c(+)载体;随后4种重组质粒分别先后转化大肠杆菌DH5α和BL21;鉴定正确后在1mmol/L IPTG的诱导下分别表达4种重组蛋白;应用亲和层析法分别纯化获得各目的蛋白,蛋白凝胶电泳初步鉴定。HCV不同基因型不同区域重组蛋白的抗原性分析 <WP=5>分别以5种HCV单片段抗原(C、NS3 1型、NS3 6型、NS4或NS5)检测90份抗-HCV抗体阳性血清和126份大学生体检血清以及39份阴性质控血清;结果90份阳性血清中共有83份可与一种或多种单片段抗原反应,阳性率分别为86.7%(C)、73.5%(NS3 1型)、71.1%(NS3 6型)、60.2%(NS4)和50.0%(NS5),其中有7份标本以NS3-1型抗原检测阴性,但可被NS3-6型抗原检出,反之,有9份血清以NS3-6型重组蛋白检测为阴性,而NS3-1型检测阳性;仅与C、NS3、NS4和NS5一种抗原发生反应的分别有7份、3份、2份和3份血清标本,126份大学生体检血清和39份阴性质控血清经各单片段抗原检测均阴性;结果显示从HCV不同基因序列来源的不同基因区域的片段重组抗原的免疫反应有所差别,所以在发展HCV抗体检测试剂时应考虑这一点。抗-HCV抗体 ELISA一步法的建立及应用我们在分析了HCV不同序列不同区域重组蛋白抗原性差别的基础上,建立了含有5种单片段蛋白混合抗原的ELISA一步法检测抗-HCV并进行了相关试验;结果90份抗-HCV阳性血清有83份被混合抗原检测出,其中有16份经PCR检测为阳性的标本用本方法检测也全部阳性,126份大学生体检血清和39份阴性质控血清经混合抗原检测均阴性,稳定性试验显示该检测试剂在4℃可以至少保存6个月,重复性试验显示其变异系数在10%以内;结果表明建立的抗-HCV抗体ELISA一步法检测试剂具有方便、快速等特点。综上所述,HCV不同基因型不同基因区域编码的片段重组抗原的抗原性有所差别,HCV序列的高度异质性对于重组蛋白的抗原性有重要影响;所以在发展HCV的诊断试剂时,应该对HCV抗原大量筛选;但是由于HCV基因的高度异质性,筛选出能够与不同序列HCV毒株都有良好反应性的优势抗原可能非常困难。