拟南芥AtGRXC9基因的功能研究

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谷氧还蛋白GRX是一类以CXXC/S基序为活性位点的小分子热稳定蛋白,参与多种谷胱甘肽依赖的氧化还原反应。这一类蛋白的最初研究开始于菌类,之后在人类中也展开了研究。近几年来在植物中也开始了研究,并且取得了很大的进展。本论文主要对拟南芥GRX类蛋白家族成员AtGRXC9基因的功能进行了研究,取得进展如下:  1、RT-PCR检测AtGRXC9基因在拟南芥不同组织、器官中的表达,结果发现AtGRXC9的表达无组织特异性,其在根、茎、叶、花、角果中均能表达,并且与GUS显色结果基本一致。  2、通过构建p35S∷AtGRXC9∶GFP融合表达载体,转化拟南芥原生质体,共聚焦显微镜观察发现AtGRXC9基因编码的蛋白定位于细胞质和细胞核。  3、利用三引物法鉴定了突变体纯合体,用RT-PCR证明grxc9突变体是AtGRXC9基因的敲减突变体。  4、利用RT-PCR分析了野生型拟南芥在不同胁迫条件下AtGRXC9基因的表达水平,结果显示,AtGRXC9的表达受MV、高光、NaCl、甘露醇、ABA以及黑暗等胁迫诱导。然而用NaCl、甘露醇、ABA和黑暗处理野生型和grxc9突变体植株,发现两者没有明显的表型差异。  5、用MV处理在平板上生长的野生型和突变体幼苗,结果发现突变体绿苗率明显低于野生型,突变体对MV更加敏感。  6、构建p35S∷AtGRXC9过表达载体,分别转化拟南芥野生型和grxc9突变体,通过Kan抗性筛选及RT-PCR鉴定,获得转基因纯合体株系。在平板上用 MV处理不同基因型的幼苗,发现互补株系对MV的敏感性明显高于突变体;用MV处理各种基因型的土培苗,结果发现各基因型植株没明显表型差异,表明AtGRXC9基因只是在幼苗期发挥抗氧化作用,通过RT-PCR检测到氧化胁迫相关基因GPX3,UGT71C1,CSD1,CAT1,FSD1等在MV处理后在不同基因型的幼苗中的表达量有明显差异,表明AtGRXC9基因直接或间接参与了植物的抗氧化胁迫。  7、在土培苗中,过表达植株的叶片明显要小于野生型和突变体,通过微分干涉差显微镜观察不同基因型叶片的细胞,发现过表达植株的栅栏细胞明显变小,但不同基因型之间细胞总数相差不大,这表明AtGRXC9基因影响叶片大小主要是通过影响细胞的体积;同时我们检测了调控叶片长宽的关键基因LNG1和LNG2的表达情况,发现这些基因在过表达与野生型植株中的表达量有明显差异,表明AtGRXC9基因参与了叶片大小的调控。  综上所述,AtGRXC9基因为组成型表达,其蛋白定位于细胞质和细胞核,在植株幼苗期发挥抗光氧化的功能,在植株成苗期会导致叶片变小。  
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