第一部分表皮肿瘤中缺氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子的表达实验目的：皮肤基底细胞癌(BCC)和皮肤鳞状细胞癌(cSCC)在人类皮肤恶性肿瘤中是最常见的,其生长过程分为两个阶段,分别为无血管期和血管期,发展过程从无血管缓慢生长逐渐转变为有血管的快速的增长,当血液供应不足,不能满足肿瘤生长发育的需要时,将导致肿瘤内部缺氧,从而引起一系列促进血管新生因子的表达来诱导肿瘤产生新的血管的形成。肿瘤的发生发展离不开血液营养的供应,而新生血管的生成将保证肿瘤获得充足的营养供给,导致肿瘤得以迅速生长并可对周围组织浸润、侵袭和发生远处转移。随着研究的深入,人们发现在肿瘤新生血管生成过程中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor, HIF-1α)发挥非常重要的作用。本项实验研究的目的是探讨皮肤基底细胞癌(BCC)及皮肤鳞状细胞癌(cSCC)组织中缺氧诱导因子-1α (HIF-1α)与血管内皮生长因子(VEGF)的表达,并分析它们的相关性及临床意义。实验方法：收集我院病理科及皮肤病理研究室2010年1月-2014年12月存档皮肤癌组织蜡块,BCC 56例,cSCC46例,共102例,其中男性61例、女性41例,年龄中位数为58(26-90)岁。选择同一时期采集的正常皮肤组织标本40例做为对照,其中男性22例、女性18例,年龄中位数为44(20-68)岁。病例组与正常对照组,均无合并重要脏器疾病史,无放疗及化疗等治疗病史。病例组与对照组之间年龄、性别等差异均无统计学意义。取材部位分别来自头面部、躯干、四肢及会阴等部位,应用即用型快速免疫组化MaxVisionTM法检测56例皮肤BCC、46例cSCC和40例采集的正常皮肤组织样本中的HIF-1α和VEGF的表达。采用SPSS17.0软件对数据进行统计学分析,采用两个样本均数比较的t检验对计量资料进行分析,采用x2检验和Scheffe方法对计数资料进行分析,采用计算Spearman相关系数对不符合双变量正态分布资料进行分析,α=0.05作为显著性水准,P<0.05有显著性差异,具有统计学意义。实验结果：1 VEGF阳性染色主要定位在细胞的胞质中,部分血管的内皮细胞、外毛根鞘细胞也可见到弱表达,新生血管旁的肿瘤细胞可见到高度表达。在皮肤基底细胞癌(BCC)中,VEGF蛋白的阳性表达率为33.93%(19/56)；在皮肤鳞状细胞癌(cSCC)中,VEGF蛋白的阳性表达率为67.39%(31/46)；在正常皮肤中,VEGF蛋白表达率为12.50%(5/40)。与正常皮肤相比,在BCC和cSCC中VEGF呈现明显的高表达,差异具有统计学意义(P<0.05)；并且VEGF的表达在cSCC中又明显高于BCC(P<0.05)。2HIF-1α阳性染色主要定位在肿瘤细胞胞浆中,也可偶见于胞核着色,在肿瘤坏死区域的周边也可见到阳性细胞,在部分血管的内皮细胞中也可见到阳性着色。正常皮肤则呈现阴性表达。在皮肤基底细胞癌(BCC)中,HIF-1α蛋白的阳性表达率为48.32%(27/56)；在皮肤鳞状细胞癌(cSCC)中,HIF-1α蛋白的阳性表达率为82.60%(38/46)；在正常皮肤中,HIF-1α蛋白无表达。与正常皮肤相比较,在BCC和cSCC中,HIF-1α呈现明显的高表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。3在BCC与cSCC中,VEGF阳性病例中有5例HIF-1α呈现阴性；HIF-1α阳性病例中有20例VEGF呈现阴性,两者的表达呈正相关(rs=0.536,P<0.05)。研究结论：在皮肤基底细胞癌(BCC)与皮肤鳞状细胞癌(cSCC)中,VEGF和HIF-1 α高表达,表明两者通过促进皮肤肿瘤新生血管的生成来促进BCC与cSCC的生长、浸润或向远处转移中发挥着重要作用。VEGF表达和HIF-1α表达呈正相关,提示两者在促进BCC与cSCC的生长发展、浸润或转移中发挥协同作用。第二部分缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)小干扰RNA对皮肤肿瘤细胞血管内皮生长因子的表达影响实验目的：大多数研究表明,HIF-1α调控着缺氧诱导表达的多种基因如血管生成素、血小板源性生长因子、胎盘生长因子和血管内皮细胞生长因子(VEGF)等的生成,因而可将其作为缺氧的固有标志并且可为肿瘤的发展提供一个更为准确的检测手段。前期实验研究中发现,在BCC和cSCC组织中,HIF-1α及其下游的靶基因VEGF的表达均是增高的,HIF-1α在VEGF启动子上的位点与其结合,从而启动VEGF的转录和表达,从而使肿瘤细胞适应缺氧环境。在BCC和cSCC中,VEGF与HIF-1α的蛋白表达呈正相关,提示两者可共同促进肿瘤血管的生成和细胞的增殖。目前,对于BCC和cSCC的治疗,仍以手术方法为主,不适合手术或者有远处转移者可行放疗和化疗。放疗和化疗虽能有效消灭肿瘤细胞,但很难实现精准的靶向治疗,在治疗过程中导致很多正常细胞死亡,对人体造成损害。因此,实现肿瘤的靶向治疗是重要的发展方向。先前的研究提示了缺氧机制可能参与了BCC和cSCC的发生和发展。鉴于HIF-1α在肿瘤的发生发展中发挥的重要作用,人们越来越重视以HIF-1α为靶点的肿瘤生物治疗方法,抑制肿瘤细胞HIF-1α基因的表达,阻断肿瘤细胞缺氧信号的传递等治疗方法已成为新的研究方向,而针对HIF-1α靶基因的RNAi (RNA interference, RNAi)方法可以使其结构域失活或者抑制HIF-1α基因的表达,从而阻断HIF-1α的生物学作用,将是一个有效的方法来控制恶性肿瘤的发展,提高患者的生存率。本实验研究目的是通过RNAi方法抑制HIF-1α基因表达,并探讨HIF-1α-siRNA对皮肤肿瘤细胞中HIF-1α mRNA和VEGF mRNA及蛋白的表达水平的影响。实验方法：采用广州市锐博生物科技有限公司设计软件,根据siRNA的设计原则,构建目的基因的si RNA和阴性对照NC(Negative Control),其序列由广州市锐博生物科技有限公司提供。构建针对HIF-1α的特异性小干扰RNA,同时构建转染阴性对照组,采用瞬时转染人皮肤鳞癌细胞A431细胞,在低氧状态下培养3天,提取细胞总RNA和蛋白。采用RT-qPCR方法和Western blot方法检测HIF-1α mRNA和VEGF mRNA及蛋白的表达水平变化。采用凝胶分析软件分析条带光密度值,计算RT-qPCR实验结果,采用凝胶图像处理系统分析目的蛋白与内参β-actin条带灰度值,表达Western Blot实验结果。采用SPSS 17.0统计分析软件分析实验数据,计量资料两个样本均数比较应用t检验,多组比较采用单因素方差分析,以α=0.05作为显著性水准,P<0.05有显著性差异,具有统计学意义。实验结果：1 RT-qPCR与Western Blot结果显示,转染HIF-1α-siRNA皮肤肿瘤细胞低氧培养后,与空转染对照相比,siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3对HIF-1 a mRNA及蛋白表达均有抑制作用(P<0.05)。2RT-qPCR与Western Blot实验结果显示,转染HIF-1α-siRNA组与空转染对照组、阴性转染siRNA对照组相比,低氧培养人皮肤鳞癌细胞A431细胞中VEGF mRNA及蛋白表达水平均下降,有显著性差异(P<0.05)。研究结论：通过采用RNA干扰技术抑制HIF-1α基因的表达,可以抑制低氧条件下皮肤鳞癌细胞与血管发生相关基因VEGF表达的上调机制,导致VEGF mRNA水平和蛋白水平的表达均显著下调,这也证明了HIF-1α是通过转录激活途径参与低氧诱导皮肤鳞癌细胞VEGF的生成,从而刺激肿瘤新的血管形成。下调低氧条件下培养皮肤鳞癌A431细胞中HIF-1α基因的表达,可明显抑制VEGF在基因和蛋白水平的表达,由此可见,低氧状态下皮肤鳞癌A431细胞中VEGF的表达受HIF-1α调控。