【摘 要】
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米多霉素生物合成中的胞苷酸羟甲基化酶MilA,是迄今发现的首个高效利用核糖核苷酸底物(胞苷酸CMP)的羟甲基化酶。然而,其所在超家族中的胸苷酸合成酶(TS)和脱氧胞苷酸羟甲基
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米多霉素生物合成中的胞苷酸羟甲基化酶MilA,是迄今发现的首个高效利用核糖核苷酸底物(胞苷酸CMP)的羟甲基化酶。然而,其所在超家族中的胸苷酸合成酶(TS)和脱氧胞苷酸羟甲基化酶(CH),均高效利用脱氧核糖核苷酸底物(分别是脱氧尿苷酸dUMP和脱氧胞苷酸dCMP)。它们对于核糖/脱氧核糖底物选择性的机理尚未阐明,而这正是核苷酸代谢研究中的重要问题。本研究通过表征MilA对于底物CMP和dCMP的酶动力学参数,证实了该酶对于CMP的底物偏好性,其对CMP的催化效率(kcat/KM)约为dCMP的8.5倍。H218O喂养MilA的体外反应结果表明,18O被引入到产物的羟甲基中,这证明MilA与CH具有相似的催化机制,为后续的MilA同源蛋白结构比较提供了基础。MilA及其同源蛋白的氨基酸序列和预测的二级结构比对结果表明,它们之间的氨基酸序列一致性虽然不足30%,但是它们的二级结构显示出较高的一致性。预测出的MilA三维结构也与CH晶体结构相吻合。氨基酸序列和活性位点比对结果显示,MilA底物结合口袋中Lys133和Ala176可能因其较短的侧链,使得该口袋较大,从而能够高效率地催化CMP。根据这一假说设计、构建并纯化了3个MilA单氨基酸突变酶( MilA K133R、A176S、A176T )和2个双氨基酸突变酶A176S/K133R、A176T/K133R,它们在氨基酸位点133和176处具有不同程度较长的氨基酸侧链。这些突变酶的体外催化反应表明,MilA A176T和MilA A176T/K133R均保留了对dCMP的催化活性,但是无法利用CMP作为底物。综上所述,MilA特殊的核糖底物偏好性是由Ala176直接决定的,A176T单氨基酸突变的引入就能够在不影响利用dCMP的前提下,阻断对天然底物CMP的催化反应。
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