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慢性髓细胞白血病(Chronic myelogenous leukemia,CML)是一种起源于多能造血干细胞异常的骨髓恶性增生性疾病,其最大的遗传学特点是存在特异性的Ph染色体,即9号染色体上的原癌基因c-abl和22号染色体的断点集中区(bcr)易位形成融合蛋白(p210bcr-abl),转录活性受bcr启动子控制。p210bcr-abl具有异常增高的酪氨酸激酶活性(Protein tyrosine kinase,PTK),使造血干细胞发生异常转化而导致CML发生。为了研究CML发生、发展和转归,人们一直在尝试利用不同启动子制备BCR-ABL转基因小鼠模型。但多数BCR-ABL转基因小鼠却表现为急性淋巴细胞白血病,试验结果并不满意,主要原因在于所采用的启动子不能使p210bcr-abl特异性的在造血干细胞和髓系细胞中表达。bcr启动子是控制BCR-ABL融合基因表达的天然启动子,是制备BCR-ABL转基因小鼠的首选启动子。然而其在转基因小鼠体内是否能驱动目的基因进行组织器官特异性的表达,国内外尚未见文献报道。本研究采用显微注射法制备bcr启动子启动-报告基因egfp表达的转基因小鼠,为在活体水平验证bcr启动子的启动特异性,制备BCR-ABL转基因小鼠模型奠定基础。一、pbcr-EGFP真核表达载体的构建及验证以慢性髓性细胞白血病细胞株K562细胞基因组为模板,PCR扩增了1.1 kb bcr启动子,在扩增的上游引物加入了AseⅠ酶切点,下游引物加入了EcoRⅠ酶切位点。AseⅠ、EcoRⅠ双酶切pEGFP-N1真核表达质粒载体,去除载体自身的CMV启动子,将1.1 kb bcr启动子定向克隆到EGFP绿色荧光蛋白报告基因上游。将重组质粒采用脂质体转染法瞬时转染K562细胞和NIH3T3细胞,24小时后观察到有荧光表达。结果显示构建成功,为进一步制备bcr-EGFP转基因小鼠奠定了基础。二、bcr-EGFP转基因小鼠的制备及初步表达检测将pbcr-EGFP质粒用AseⅠ与AflⅡ限制性内切酶消化,回收纯化约为2.1 kb的基因片段。注射PMSG和HCG使6-8周龄的C57雌性小鼠超数排卵,与ICR雄性小鼠进行交配,然后取受精卵1186枚,通过原核显微注射法将pbcr-EGFP表达载体片段注射到受精卵雄原核中,取注射后状态良好的受精卵683枚,移植到35只受体鼠输卵管中,受体鼠怀孕30只,共生产首建鼠110只,经过PCR检测,4#(♀)、36#(♂)和81#(♂)等3只F0代为转基因整合阳性。将转基因小鼠分别与正常小鼠交配,产生的后代经PCR检测表明,4#后代(F1代)整合率为36.3%(4/11);81#后代(F1代)整合率为55.6%(5/9);36#转基因小鼠正在合笼中,目前尚无后代。经检测整合阳性的F0代小鼠鼠尾采血,制作外周血涂片,通过荧光显微镜观察绿色荧光的表达情况,对bcr启动子的表达特异性进行初步鉴定。结果显示,已经获得的整合阳性的转基因小鼠的外周血涂片均没有观察到绿色荧光蛋白的表达,目前正积极准备将用于进行进一步检测的多种实验方法。