第一部分减重手术对2型糖尿病大鼠胰岛功能的改善作用及机制研究研究背景糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是一种严重危害人类生命健康的慢性代谢性疾病。2017年,全球糖尿病患者总数已达到4.25亿,其中我国糖尿病负担最重,患者人数达1.14亿,占全球近27%。2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus,T2DM)的发病率在过去几十年呈现快速上升的趋势,且新增患者大多集中于中低收入的发展中国家。糖尿病治疗及预防带来了沉重的经济和社会负担,已成为亟待解决的公共卫生问题。2型糖尿病是缓慢进展性疾病,其自然病程往往表现为正常糖耐量一糖耐量受损→T2DM,其中胰岛β细胞功能受损是其发病和病情进展的基础,且往往在发病早期就已经存在。进入失代偿期之后,糖耐量异常则进一步进展为T2DM。越来越多的研究证实,慢性炎症加上糖毒性及脂毒性,是β细胞功能进行性下降的重要发病机制,而NLRP3炎性小体在胰腺慢性炎症进展的病理过程中发挥了重要的作用。NLRP3(Nod-like receptor family pyrin domain containing 3)属于核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLR)家族模式识别受体,NLRP3炎性体是由NLRP3、调节蛋白一自噬相关的斑点蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein,ASC)和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶caspase-1等组成的蛋白复合体。炎性体被激活后能够迅速活化caspase-1,并且进一步切割IL-1β和IL-18前体分子并促进其分泌,进而参与炎症反应。进来许多研究表明,NLRP3炎性小体在T2DM的发生和进展中发挥了重要作用。减重手术(Bariatricsurgery)又被称为代谢手术,该手术设计初衷为治疗病态肥胖,但长期研究提示,减重手术在取得明显减肥效果的同时,还可以有效缓解与肥胖并发的T2DM,更迅速持久地达到治疗效果。目前,减重手术已被美国糖尿病协会(ADA),国际糖尿病联盟(IDF)以及中华医学会糖尿病学分会正式纳入治疗指南。有学者观察到,减重手术后患者胰岛β细胞功能得到改善,但其具体机制不明。研究目的本研究旨在通过以高脂饮食(High fat diet,HFD)联合小剂量链脲霉素(Streptozotocin,STZ)所诱导的T2DM大鼠模型,验证以下假说:(1)十二指肠空肠旁路术(Duodenal-jejunal bypass,DJB)可以有效改善T2DM大鼠受损的胰岛功能;(2)位于胰岛巨噬细胞的NLRP3炎性小体在DJB术后胰岛功能改善的机制中发挥重要作用。研究方法本研究首先通过高脂饮食喂养SD大鼠(持续4周)诱导胰岛素抵抗的产生,然后通过腹腔注射链脲霉素(35mg/kg)诱导高血糖,模拟人体T2DM的自然发病过程及代谢特点。建模成功的T2DM大鼠被随机分为假手术组(SHAM)与DJB手术组并分别实施手术。DJB保留了胃的完整性,是目前应用于研究代谢手术不依赖于减重作用的抗糖尿病机制的良好手术模型。术后两组大鼠主要对以下指标进行检测,(1)体重,进食量,及空腹血糖:各组均在相应时间点对相应参数进行记录;(2)糖耐量:在术前及术后时间点分别进行了口服糖耐量实验(Oral glucose tolerance test,OGTT)及腹腔注射糖耐量实验(Intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT);(3)胰岛β细胞功能:通过在体及离体的葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验(Glucose-stimulated insulin secretion,GSIS),以及 β 细胞质量测量、胰腺胰岛素含量等指标进行评估;(4)胰岛炎症反应状况:通过免疫组化,PCR,Western Blot等技术对胰岛巨噬细胞浸润及NLRP3炎性小体通路进行评估;(5)肠促胰岛素:测量各组在相应时间点的胰高血糖素样肽(Glucagon-like peptide 1,GLP-1)水平;(6)胰岛细胞凋亡:通过 TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡。在术后10周时,DJB组大鼠再随机分为三组,进行巨噬细胞重构实验:其中第一组通过腹腔注射提前培养好的野生型巨噬细胞,第二组则通过腹腔注射NLRP3基因敲除的巨噬细胞,第三组则注射等量的生理盐水作为对照。然后对巨噬细胞重构后的DJB大鼠重复上述6项实验指标的检测。研究结果(1)高脂饮食喂养联合低剂量STZ腹腔注射成功诱导了 2型糖尿病SD大鼠模型,模拟了人体T2DM的自然病程。(2)DJB组大鼠与假手术组相比,其进食量及体重在术前及术后各个时间点均无明显差异(P>0.05)。(3)与假手术组相比,DJB可快速有效地降低T2DM大鼠的空腹血糖,并可显著持久地改善T2DM大鼠的糖耐量:术前各组大鼠空腹血糖及糖耐量实验结果并无明显差异(p>0.05),自术后2周起,假手术组大鼠空腹血糖明显高于DJB组(p<0.01);术后2周时,无论OGTT与IPGTT实验均表明DJB组较假手术组糖耐量得到明显改善(p<0.01),4周后则进一步改善。(4)DJB术后大鼠的胰岛分泌功能得到改善:在体实验及离体细胞培养实验均表明,DJB组大鼠葡萄糖刺激的胰岛素分泌水平较假手术组明显升高(p<0.05);和假手术组相比,与胰腺葡萄糖转运的密切相关的GLUT2及GCK的mRNA表达量在DJB组明显上调(p<0.01)。(5)DJB术后血清GLP-1水平较假手术组明显升高(p<0.01)。(6)DJB术后大鼠胰腺巨噬细胞浸润减轻,NLRP3炎性通路活性下调:免疫组化及PCR结果表明,DJB术后大鼠胰腺巨噬细胞浸润(CD68+)较假手术组明显好转;免疫组化、Western Blot及PCR结果均表明,DJB组大鼠胰腺NLRP3蛋白及mRNA表达量较假手术组显著下调(p<0.01);DJB组大鼠胰腺p65-NFκB蛋白及caspase-1蛋白表达量较假手术组明显降低,胰腺促炎因子IL-1β、IL-18等的蛋白表达及mRNA表达量均较假手术组明显下调,抗炎因子GFB1,IL-10,ARG1的表达量明显上调(p<0.05);(7)通过向DJB术后大鼠腹腔注射野生型巨噬细胞,可重建T2DM状态下的胰腺炎性状态,而腹腔注射NLRP3基因敲除的巨噬细胞后,DJB大鼠胰腺功能未受影响:与腹腔注射生理盐水的对照组相比,腹腔注射野生型细胞的DJB组大鼠,其空腹血糖再次升高,葡萄糖刺激的胰腺分泌功能下降,胰岛体积、β细胞质量、胰腺胰岛素含量均下降,NLRP3及相关促炎因子表达再次升高(p<0.05);而注射NLRP3基因敲除巨噬细胞的DJB大鼠,上述实验指标均较对照组无显著差别。结论DJB可以通过下调T2DM大鼠胰腺巨噬细胞NLRP3炎性小体活性,介导其胰腺功能的改善。第二部分减重手术对2型糖尿病大鼠肾功能的改善作用及机制研究研究背景糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最为常见的微血管并发症,是DM病人高病死率及高致残率的主要原因。在世界范围内,糖尿病肾病已成为引起终末期肾脏疾病(End-stage renal disease,ESRD)的首要病因,给社会与家庭带来了沉重的经济负担。在我国,至少有50%的T2DM患者合并不同程度的肾功能不全,随着糖尿病发病率的逐年增高,糖尿病肾病已成为影响我国人民生命健康的重大慢性疾病之一。目前对于糖尿病肾病尚缺乏特异性的治疗手段,传统的治疗策略为综合性防治,包括控制血糖血压,纠正脂质代谢紊乱,以及对于肾素-血管紧张素-醛固酮(Renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)抑制剂的应用,对于终末期的患者,则往往需要依赖透析或行肾脏移植等替代治疗。对于糖尿病肾病的早期预防和诊疗,以及特异性的靶向治疗,已成为近来研究的热点。减重手术作为治疗病态肥胖及糖尿病的有效手段,已被越来越多的应用于临床实践。早在2005年,Ikramuddin等报道一位经保守治疗无效的DN患者,行胃旁路术后2年尿蛋白降至正常水平。随后陆续有临床及动物实验证实,减重手术对于DN可以达到一定的治疗效果。但目前对于减重手术治疗DN效果的相关研究,多为回顾性、小样本研究,且纳入的观察指标相对局限,缺乏系统的随机对照试验。对于减重手术改善DN的机制,目前尚不明确。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是一类转录本长度超过200核苷酸单位(nt)的RNA分子。LncRNAs广泛地参与到机体几乎所有的生理病理活动中,其通过在表观遗传水平、转录及转录后水平调控基因的表达,与多种疾病密切相关。肺腺癌转移相关转录本1(Metastasis associated lung adenocarcinoma transcriptl,MALAT1)最初被发现是一种与肿瘤及代谢性疾病相关的lncRNA。近来有研究证实,MALAT1参与调控糖尿病微血管病变的发生发展,但其具体调节机制尚不明确。研究目的通过本研究的开展,我们期待解决以下问题:(1)评估HFD联合低剂量STZ腹腔注射构建的T2DM大鼠模型的肾功能受损情况;(2)验证DJB手术是否能够改善T2DM大鼠受损的肾功能;(3)探究IncRNA MALAT1是否在DJB术后大鼠肾功能的改善机制中发挥重要作用。研究方法动物实验部分:通过高脂饮食喂养(持续4周)联合低剂量STZ注射(35mg/kg)构建2型糖尿病SD大鼠模型,在维持糖尿病状态6周后,将SD大鼠随机分为3组,分别为DJB手术治疗组(DM-DJB),假手术治疗组(DM-sham),以及糖尿病对照组(DM)。然后分别实施DJB手术及假手术,糖尿病对照组不做任何处理,另外选取同龄健康SD大鼠作为空白对照组(CON)。术前及术后各时间点检测并记录各组动物的体重,进食量,及糖耐量水平;同时检测评估各组在不同时间点的尿白蛋白排泄率(Urinary albumin excretion rate,UAER)和肾小球滤过率(Glomerular filtration rate,GFR);并对各组大鼠的肾组织切片进行病理学评估;同时通过PCR技术和(或)ELISA技术检测MALAT1及其调节通路关键因子的表达水平。细胞离体实验部分:我们选用肾小管上皮细胞株HK-2进行离体细胞实验。首先我们在不同葡萄糖浓度梯度的培养基中培养HK-2细胞系,模拟糖尿病肾病状态下的高糖环境,然后siRNA转染沉默MALAT1,并检测与DN发病和进展密切相关的炎性分子以及MALAT1下游通路蛋白的表达水平。研究结果(1)高脂喂养的SD大鼠经STZ腹腔注射诱导后出现明显的体重增长变缓,尿量增加,空腹血糖升高,糖耐量受损等糖尿病症状;STZ注射后第6周,糖尿病组大鼠的肾小球滤过率及尿白蛋白排泄率均明显高于空白对照组(p<0.05),出现了明显的肾功能损伤。(2)大鼠行手术处理过后,与糖尿病对照组及空白对照组相比,DJB组与假手术组在术后两周内出现一过性的体重及进食量下降;其余时间点各组的体重及进食量无明显差异(p>0.05)。(3)与假手术组及糖尿病对照组相比,大鼠行DJB术后其糖耐量水平得到迅速明显地改善(p<0.05),术后两周已与健康大鼠无明显区别。DJB组大鼠血清GLP-1水平较糖尿病对照组及假手术组明显升高(p<0.01)。(4)与假手术组及糖尿病对照组相比,DJB大鼠的肾小球滤过率及尿白蛋白排泄率显著降低(p<0.05),受损的肾功能得到了一定程度的缓解,但仍高于健康的空白对照组。(5)肾脏切片PAS染色观察结果显示,与健康对照组相比,糖尿病组及假手术组的SD大鼠肾小球体积明显增大,系膜基质明显增生,出现了典型的糖尿病肾病的病理学表现;而DJB组大鼠的肾小球水肿及系膜基质增生得到了明显的缓解。(6)与假手术组及糖尿病对照组相比,DJB大鼠肾脏组织中MALAT1及其下游靶点血清淀粉样蛋白抗原3(Serum amyloid A protein 3,SAA3)的表达水平明显下调(p<0.05),接近健康空白对照组水平。(7)与糖尿病肾病发生发展密切相关的炎性因子白介素-6(Interleukin-6,IL-6)及肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)在糖尿病组及假手术组大鼠肾脏组织中的表达水平明显升高,DJB组大鼠IL-6和TNF-α表达水平较假手术组显著下调(P<0.01)。(8)与正常葡萄糖浓度培养基(5.5 mM D-glucose)以及高渗对照组培养基(30 mM L-glucose)培养的HK-2细胞系相比,高糖组(30 mM D-glucose)HK-2细胞的MALAT1表达水平明显上调(p<0.01)。(9)通过siRNA转染沉默MALAT1可以显著下调HK-2细胞系高糖培养状态下升高的SAA3、IL-6及TNF-α的表达水平。结论DJB可以缓解T2DM大鼠受损的肾功能,MALAT1及其下游通路SAA3,IL-6,和TNF-α在此改善机制中发挥重要作用。