三角帆蚌是我国重要的淡水珍珠蚌,有相关研究表明雄性三角帆蚌的产珠性能相较雌性具有优势,三角帆蚌、双壳纲乃至整个软体动物门的性别形成机制都缺乏系统性的探究,作为较为低等的动物,性别表现形式的多样性往往是性染色体上或胞质性别相关基因和环境因素共同作用产生的结果。在高等脊椎动物性别决定和分化中存在一些已被证实的信号通路基因,本实验选取了其中三个较为经典的Transformer-2α,β-catenin和SOX2基因,对三角帆蚌这3个基因的序列、结构、雌雄各组织表达、早期发育时期的表达以及细胞定位进行研究,初步探讨这些基因在三角帆蚌性别决定和性别分化的功能。另外在前期工作基础上,对M型COII基因3’端特有序列的功能进行初步研究,探讨其在性别分化中的作用。1.三角帆蚌Transformer-2α基因的克隆与表达分析克隆得到了三角帆蚌的Transformer-2α的cDNA序列全长,为1867bp,其中包括92bp的5’非翻译区和881bp的3’非翻译区,开放阅读框为894bp,编码297个氨基酸。预测其蛋白相对分子量为34661.2,理论等电点为11.02,不具备信号肽也不具备跨膜结构,具有RNA识别基序(RRM)和一个丝氨酸/精氨酸富集区域(SR)。荧光定量结果显示Transformer-2α基因在雄性各组织的表达均高于所对应的雌性组织,推测Transformer-2α基因在雌雄中存在不一样的剪切体进而导致性别朝不同方向分化。时期表达发现胚胎期3天左右存在一个表达峰值说明可能在胚胎发育中发挥重要作用。原位杂交结果显示雌雄性腺中都存在信号,说明了该基因的双向剪切功能。2.三角帆蚌β-catenin基因的克隆与表达分析克隆得到了三角帆蚌β-连环蛋白(β-catenin)基因的cDNA序列,全长为5544bp,开放阅读框2463bp,编码氨基酸820个,5’非翻译区1355bp,3’非翻译区1726bp,没有信号肽也没有跨膜结构。蛋白结构域中央为12个犰狳重复结构域(ARM),该结构域在物种间保守度极高。雌雄各组织的荧光定量结果显示除外套膜外,雌性各组织的表达量都显著高于雄性(P<0.01),β-catenin基因本身就是亲卵巢的基因,说明其在雌性性腺发育过程中的重要性。时期定量在胚胎期第3天出现了峰值,推测参与了胚胎发育过程。原位杂交信号在雌性中较雄性较强,总而言之,β-catenin基因在雌性性别形成中发挥举足轻重的作用,而在雄性中并不是必需的。3.三角帆蚌SOX2基因的克隆与表达分析克隆了三角帆蚌的SOX2基因的cDNA序列,序列全长为1840bp,5’UTR为163bp,3’UTR为1005bp,开放阅读框为672bp,氨基酸223个。3’端存在AATAAA盒子和PolyA尾,3’UTR内存在9个ATTTA单元。分子量为25136.15u,理论等电点为10.19,平均亲水系数为-1.243,谷氨酰胺在氨基酸组成中所占比例最高,为10.3%,无信号肽和跨膜结构。氨基酸序列包含由72个氨基酸组成的HMG-box和由48个氨基酸组成的SOXp结构域,因此可以断定属于SOX家族基因。荧光定量结果显示雌雄都在斧足中表达量最高,肝脏中基本不表达,雌性性腺表达量显著高于雌性,说明了SOX2基因的多功能性。时期表达也显示在3天左右最高,也参与到了胚胎的发育过程。原位杂交结果显示雌性信号更强。4.M型COII基因的Western blot实验分析本课题组研究工作表明三角帆蚌线粒体基因序列中存在M型和F型COII基因2种不同序列,其中M型COII基因3’末端比F型多出546bp的序列,利用这一多余且猜测可能存在功能性的序列设计特异性抗体检测雌雄各组织表达,发现只存在雄性性腺,其余组织和雌性中基本没有,蛋白层面上证明该基因在雄性中特异性表达。