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研究背景皮肤是人体最大的器官,也是机体第一道天然保护屏障。它对于维持内环境稳定,免受外界有害物质侵害发挥着重要的防御作用。皮肤长期暴露于外界,是紫外线照射后最易遭受损伤的器官。长期紫外线照射使皮肤衰老提前,引起皮肤外观、结构及功能改变,表现为皮肤粗糙、皱纹加深、色素沉着或脱失、癌前病变及癌变等。长波紫外线(UVA)是到达地球表面紫外线的主要组成部分,占90%左右,且穿透力强可进入真皮,人皮肤成纤维细胞是真皮的重要组成部分,因此成纤维细胞成为UVA作用的主要靶细胞。在UVA致氧化损伤和凋亡作用的体内外实验中发现,UVA照射皮肤一方面产生具有强生物活性的活性氧簇(ROS),如超氧化物阴离子、氢氧根、单线态氧、过氧化氢等。另一方面还通过产生一氧化氮(NO)诱导细胞内氧化损伤和凋亡。NO是生物体中一种重要的氧化还原信号分子和毒性分子,也是一种生物活性氮,它作为一种极不稳定的生物自由基,可以损伤正常细胞。UVA照射皮肤通过产生极强活性的自由基团,一方面引起蛋白质和酶的破坏,另一方面则导致DNA的氧化损伤。活性氧与核酸反应可形成许多不同类型的碱基修饰物,最常见的为8-经基脱氧鸟嘌呤(8-oxo-dG),形成数量也最多,故通常以它作为DNA氧化损害的重要指标。自由基可启动线粒体的去极化,使线粒体膜通透性增加,导致凋亡相关的蛋白和酶类释放入细胞,激活下游效应器,加剧细胞凋亡。在凋亡过程中线粒体与许多重要事件关系紧密,研究表明,活性氧的大量产生可导致线粒体膜通透性改变(MPT)。线粒体膜通透性改变,进一步导致膜电势差降低,可引起一系列生化改变,如活化caspase蛋白酶家族,引起细胞凋亡的级联反应,加速细胞凋亡。在正常情况下,caspase酶以无活性的酶原形式存在,必须经过线粒体途径、死亡受体途径、内质网途径等激活以后才可以发挥作用。当受到凋亡信号刺激时,上游的caspase能次序的激活下游caspase,形成级联反应,将凋亡信号一级级传到凋亡底物。Caspase-3能切割大多数凋亡细胞底物和裂解许多凋亡程序中级联蛋白酶催化反应中的蛋白。所以caspase-3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路,也是凋亡的关键酶和执行者。机体本身存在两大抗氧化系统,分别是酵素型(酶促型)与非酵素型(非酶促型)。酵素型包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽还原酶(GR)、过氧化氢酶(CAT),它们本身可在体内合成,对于针对性的清除各类活性氧自由基发挥重要作用。SOD是组织细胞内主要的抗氧化酶,其生物学作用是分解超氧化物阴离子,阻断超氧化物阴离子对细胞膜及线粒体等细胞器的攻击,其活性的高低反映了组织细胞清除氧自由基的能力。当细胞内活性氧生成增加、清除活性氧能力下降和抗氧化能力减弱时可致细胞损伤,出现细胞凋亡。探索一种高效且安全性好,能够保护人体皮肤拮抗UVA照射抑制皮肤氧化损伤和凋亡的天然产品将对人类皮肤健康具有重要意义。黄芩苷是中药黄芩的有效成分之一,是一种有效的化学光防护剂,有着广泛的生物学效应。现代药理研究表明,黄芩苷具有抗炎、抗菌、抗病毒、清除自由基及抗氧化、抗变态反应、抗肿瘤,神经系统保护等药理活性。近年来随着国际上对黄芩苷研究的持续升温以及认识的逐步深入,认为黄芩苷在清除氧自由基、减轻细胞凋亡以及抗肿瘤等多方面均有作用。黄芩苷的抗氧化、清除自由基、抗炎、抗肿瘤等作用在本课题小组已得到了证实,但是在UVA对人皮肤成纤维细胞致氧化损伤和凋亡中是否有干预作用,尚未见报导。目的通过UVA联合黄芩苷处理人皮肤成纤维细胞(HDFs),观察细胞生长状态、细胞形态、相关氧化物质含量水平,胞内抗氧化能力及细胞凋亡率变化等,藉此证明黄芩苷对于在UVA照射下的人皮肤成纤维细胞具有抗光损伤作用。在前部分实验基础上,进一步观察不同浓度黄芩苷处理下,线粒体膜电位、基因氧化损伤产物的变化,通过检测凋亡相关蛋白caspase-3表达水平,来探讨黄芩苷如何通过保护细胞线粒体膜和DNA,抑制下游效应蛋白,从而发挥其抗氧化损伤和凋亡的作用。方法1.细胞培养人二倍体成纤维细胞取自成年健康男性包皮组织,由江苏省人民医院泌尿外科提供。37℃,5%C02条件下用含10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养。取5-10代对数生长期的细胞进行实验。2.紫外线照射根据实验设计定时定量进行紫外线照射,选择辐射总剂量为10 J/cm2UVA处理细胞后,选择合适浓度的黄芩苷加入培养至相应时间点。3.药物浓度筛选CCK-8法检测细胞增殖活性,以定量无细胞毒性的药物浓度进行其后实验。4.氧化应激损伤水平检测光镜下观察细胞形态;荧光显微镜和流式细胞仪检测胞内氧化产物含量,细胞凋亡率;流式细胞仪检测细胞周期G1期阻滞率;紫外分光光度法检测细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及总抗氧化能力(T-AOC)水平。5.线粒体膜电位变化检测流式细胞仪检测线粒体膜电位变化6.基因损伤水平检测免疫荧光检测光产物8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-oxo-dG)。7.凋亡相关蛋白水平检测Western Blot免疫印迹法检测蛋白caspase-3的表达。结果1.黄芩苷对UVA照射HDFs增殖的影响通过CCK-8法证实,在无UVA照射仅黄芩苷处理24小时后,与对照组相比,发现在浓度为25μg/ml及以下细胞活性与对照组无明显统计学差异(P>0.05),说明在浓度为25μg/ml及以下,黄芩苷对细胞无明显毒性作用。另外以l0J/cm2 UVA照射细胞,黄芩苷处理组中浓度为25μg/ml及以下细胞活性高于UVA组,差异有统计学意义(P<0.05),故本实验选择浓度为25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml三个药物阶梯浓度进行研究。2.黄芩苷对UVA照射HDFs活性氧、超氧化物阴离子、NO含量变化的影响通过荧光显微镜观察发现,UVA组中活性氧、超氧化物阴离子、NO的荧光强度明显高于对照组。黄芩苷处理组荧光强度较UVA组明显减弱,呈现一定的浓度依赖性。流式细胞仪定量检测显示各项氧化产物UVA组荧光强度均显著高于对照组,表现出明显统计学差异(P<0.05)。活性氧组中,黄芩苷浓度为25μg/ml和12.5μg/ml组荧光强度值与UVA照射组相比明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);在超氧化物阴离子组中,黄苳苷浓度为12.5μg/ml和6.25μg/ml组荧光强度值与UVA组相比下降,差异有统计学意义(P<0.05),而与对照组相比,差异无统计学意义;NO组中三个浓度组的荧光强度值与UVA组比较均下降(P<0.05),其中25μg/ml黄芩苷组与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。3.黄芩苷对UVA照射HDFs抗氧化应激能力的影响UVA组成纤维细胞的SOD,T-AOC活力均明显低于对照组(P值均<0.05),而MDA含量则明显高于对照组(P值均<0.05),UVA+各浓度黄芩苷处理组,其SOD,MDA含量及T-AOC活力与UVA组相比均有明显统计学差异(P<0.05)。4.黄芩苷对UVA照射HDFs细胞凋亡率的影响在荧光显微镜下观察发现,对照组细胞核形态正常,UVA照射组核大部分呈现固缩,深染,然而黄芩苷处理组细胞的异常核形态细胞比例较UVA组减少,与药物浓度呈现一定的正相关性。通过流式细胞仪定量检测,UVA组细胞凋亡率明显高于空白对照组(P<0.05)。加入黄芩苷处理后,与UVA组比较,凋亡率均有所下降,呈现显著统计学差异(P<0.05)。5.黄芩苷对UVA照射HDFs线粒体膜电位的影响黄芩苷处理组膜电位的变化较单独UVA照射组有明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),且随着药物浓度的增加,荧光强度逐渐降低,呈浓度依赖性,药物处理组间无明显统计学差异(P>0.05)。另外黄芩苷组与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。6.黄芩苷对UVA照射HDFs中DNA光产物8-oxo-dG的影响免疫荧光示光损伤标记物8-oxo-dG在UVA组细胞中强烈表达,发出强烈红色荧光,黄芩苷处理组荧光强度明显低于UVA组,而对照组中镜下几乎观察不到荧光。7.黄芩苷对UVA照射HDFs中凋亡相关蛋白caspase-3的影响经前述方法处理,UVA组中caspase-3蛋白表达明显高于对照组(P<0.05),经过黄芩苷处理后,各浓度药物处理组中,其蛋白表达较UVA组表达下降(P<0.05),另外药物处理组与对照组相比,无明显统计学差异(P>0.05)。结论本研究以探讨UVA致人皮肤成纤维细胞光损伤进程中的氧化损伤和凋亡机制为主线,通过运用免疫学、细胞生物学及分子生物学等多种方法,观察黄芩苷对UVA照射下的人皮肤成纤维细胞的光防护作用,并进一步阐述其发挥光防护作用的机制。通过筛选有效无毒的黄芩苷作用浓度及合适处理时间,观察细胞形态、氧化产物含量,细胞生长周期和胞内氧化应激水平,基因的损伤水平,线粒体膜电位变化及凋亡相关蛋白caspase-3的变化,对黄芩苷抑制UVA诱导人皮肤成纤维细胞光源性损伤的影响及机制两方面展开研究。本研究初步证实在UVA照射下,黄芩苷具有清除各类有害氧化产物的能力,减少DNA光损伤,同时通过降低线粒体膜去极化,改善其通透性,进而阻止下游凋亡蛋白caspase-3的激活和表达,来达到减轻细胞氧化应激,降低细胞凋亡的作用,藉此为黄芩苷的光防护作用及抗氧化机制提供实验依据和参考。