背景肿瘤干细胞理论认为肿瘤组织中存在肿瘤干细胞(tumor stem cells,TSCs),它们是一类具有自我更新和分化潜能的细胞,该理论让我们对肿瘤的起源、耐药、转移、复发、确定临床分期及评估预后均有一个新的认识。肿瘤干细胞最早于1994年在急性粒细胞性白血病中发现。目前已经在乳腺癌、脑肿瘤、前列腺癌、卵巢癌、肝细胞癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌等多种实体肿瘤中得到证实。2007年,Zhang等以及Wang等也发现鼻咽癌肿瘤干细胞的存在。CD133是一种具有5个跨膜区域的糖蛋白,最初作为造血干细胞表面标志被发现,其表达随着细胞的分化迅速下降。最近研究发现,CD133在多种肿瘤干细胞中表达,是肿瘤干细胞的新型标志物。我们的前期研究通过CD133磁珠分选试剂盒分选出CD133(+)鼻咽癌干细胞。肿瘤干细胞理论以及鼻咽癌干细胞的发现为鼻咽癌的治疗提供了崭新的思路——鼻咽癌的治疗关键在于针对其肿瘤干细胞的治疗。鼻咽癌目前标准治疗方案仍然以放射治疗为主。常规放疗、立体定向放疗、三维适形放疗、调强适形放疗等各种放疗技术大大改善了鼻咽癌的治疗效果,提高患者生存率。但是放疗也带来短期及长期的副作用,严重影响患者生活质量。因此,人们正在寻找一种即能提高疗效又能较少毒副作用的治疗方法。随着细胞生物学和分子生物学的发展,各种治疗基因被应用于肿瘤。其中HSV-TK/GCV(HSV-TK 即 herpes simplex virus thymidine kinase 单纯疱疹病毒胸苷激酶;GCV即ganciclovir更昔洛韦)是倍受青睐的自杀基因治疗系统(sucide gene therapy system),具有强大的细胞毒性,不仅使转染TK基因的肿瘤细胞凋亡,与其相邻的未转染的肿瘤细胞也被杀死,表现出明显的旁观者效应(bystander effect)。成功的基因治疗有赖于高效的靶向肿瘤细胞的载体。新近关于干细胞尤其是对间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的研究发现MSCs具有归巢特性,能靶向迁移至肿瘤组织及其远处转移灶,从而为鼻咽癌的基因肿瘤提供新的靶向载体。本实验在肿瘤干细胞理论的指导下,利用MSCs肿瘤归巢特性,构建含有TK基因的重组慢病毒表达载体并感染MSCs,得到稳定表达TK基因的TK-MSCs,并与CD133(+)的鼻咽癌干细胞共培养,联合GCV,观察其治疗效果。目的观察转TK基因的TK-MSCs联合GCV对鼻咽癌细胞CD133(+)细胞的靶向迁移及杀伤作用。材料及方法1材料DMEM/F12、RPMI-1640、DMEM、Opti-MEM、间充质干细胞成骨/软骨/成脂诱导分化培养基、胎牛血清、Percoll分离液、聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)、凝聚胺(ploybrene)、TK 基因扩增引物、PCR 试剂盒、DNA分子量标准、限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA凝胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、质粒DNA大提试剂盒、M-MLV第一链cDNA合成试剂盒、蛋白分子量标准、CD133磁珠分选试剂盒、Transwell小室、CCK-8试剂盒、质粒 pGL3-TK-EGFP、质粒 pCDH-CMV-HA-TK-EF1-copGFP(上海中科院巴斯德研究所蓝柯教授惠赠)、人鼻咽癌细胞株5-8F、人鼻咽癌CD133(+)5-8F细胞、人血管内皮细胞ECV、SD大鼠。2方法2.1MSCs的分离、培养和鉴定无菌条件下取SD大鼠双侧股骨,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基冲洗骨髓腔,将得到的全骨髓细胞悬液缓慢加入底部装有Percoll分离液(比重1.073g/ml)的离心管中,2500rpm离心30min,吸取中间乳白色的单个核细胞层,PBS洗涤2遍,按1.5×105/ml密度接种,37 ℃,体积分数5%CO2常规培养。3天后换液,用PBS洗去未贴壁细胞。流式细胞仪测定细胞表面标志CD29、CD34、CD44、CD45。用SD大鼠间质干细胞成骨/软骨/成脂诱导分化完全培养基分别进行诱导培养(具体方法见产品说明书)。按5×103/孔的密度将MSCs接种于96孔板(设4个复孔),从第二天起,每天于同一时间点,用CCK-8试剂盒检测450nm的吸光度值(A值),量化活细胞数,绘制细胞生长曲线,计算群体倍增时间(population doubling time,PDT)。2.2 pCDH-CMV-HA-TK-EF1-copGFP 载体的构建对NCBI上已经提交的TK(登录号AY575228)基因序列进行分析,结果:可通过EcoRI和BamHI酶切位点插入TK基因。为检测转染后胸苷激酶蛋白的表达,上游引物引物设计时在TK基因5’末端引入HA标签序列。根据以上信息设计引物如下:TK-F CGCGAATTCGCCACCATGTACCCATACGA TGTTCCAGATTACGCTATGGCTTCGTACCCCTGCCATCAAC;TK-R CGC GGATCCTCAGTTAGCCTCCCCCATCTCCCGG,以 pGL3-TK-EGFP 质粒(课题组保存)为模板进行PCR扩增,PCR反应结束后,进行琼脂糖凝胶电泳检测反应产物,并将TK基因片段切胶回收,将回收片段和pCDH-CMV-HA-TK-E F1-copGFP载体酶切并纯化,用T4 DNA连接酶4℃连接过夜,将得到的重组体转化至大肠杆菌TOP10,提取质粒进行酶切鉴定并送测序。2.3慢病毒的包装、浓缩及滴定用PEI转染试剂将△8.9质粒、pVSVG质粒、pCDH-CMV-HA-TK-EF1-copGFP 质粒共转染 293T 细胞,37 ℃,体积分数 5%C02培养24h后换液,72h后观察荧光表达,收集病毒液,以0.45μm滤器过滤,离心浓缩,-80℃保存。用完全培养基将病毒液稀释7～10个梯度并感染293T细胞,观察荧光表达,计算病毒滴度。2.4 MSCs感染及鉴定实验分4组:①第1组用重组慢病毒感染MSCs,不加助转染剂Polybrene;②第2组用重组慢病毒感染MSCs,加入Polybrene;③第3组用空病毒感染MSCs,加入Polybrene;④第4组为未感染组。感染前一天按3～5×103/孔将MSCs接种于96板(确保进行病毒感染时细胞的融合度为30-50%)。以MOI=50(由预实验得到最佳MOI为50)计算,用完全培养基稀释病毒液,按照分组加入(或不加入)终浓度为5μg/ml的Polybrene,混匀病毒液。每孔加入病毒稀释液100μl,37℃、5%CO2培养12h后换液继续培养72h,观察荧光表达,RT-PCR检测HA-TK基因mRNA的表达,Western blotting检测HA-TK蛋白表达。2.5免疫磁珠分选CD133(+)5-8F细胞取107数量级5-8F细胞悬液,buffer洗涤、重悬、离心、去上清。300μl buffer重悬细胞,加入FcR阻断剂100μl抗CD133免疫磁珠100μl,充分混匀后4℃避光结合 30 min。5 ml buffer 重悬,300rpm 离心 1Omin,弃上清,0.5 ml buffer重悬细胞。安装磁珠分选架和分选柱,3 ml buffer湿柱,将0.5 ml buffer重悬的细胞上柱,12 ml缓冲液分4次洗柱。将分选柱移出磁场,加5 ml的buffer洗柱。所得细胞重复上述步骤再次过柱分选,所得CD133(+)细胞1000rpm离心5 min,无血清培养液37 ℃,5%CO2培养。2.6Transwell小室迁移实验检测TK-MSCs的归巢特性选用直径6.5 mm,孔径8.0 μm的Transwell小室,分别检测TK-MSCs对CD133(+)5-8F细胞,CD133(-)5-8F细胞,未分选5-8F细胞,血管内皮细胞ECV等4种细胞的迁移能力,因此实验设4个组(每组设3个平行样本):①第1组下室为CD133(+)5-8F细胞;②第2组下室为CD133(-)5-8F细胞;③第3组下室为未分选5-8F细胞;④第4组下室为ECV细胞。具体步骤如下:(1)用600 μl无血清培养基重悬细胞,以1×105个/孔的密度将CD133(+)5-8F细胞,CD133(-)5-8F细胞,未分选5-8F细胞,或ECV细胞分别接种到下室,37 ℃,体积分数5%CO2培养24 h。(2)用200 μl含体积分数0.1%牛血清白蛋白无血清培养重悬TK-MSCs细胞,以1×105/孔的密度将其接种到各组的上室,37 ℃,体积分数5%C02共同培养12h。(3)取出小室,用棉签擦去上室面的细胞,下室面细胞用4%多聚甲醛固定15 min后结晶紫染色,用显微镜在高倍镜(×400)下每张膜随机观察5个视野,取平均值,计算并比较各组迁移细胞数。2.7 CD133(+)5-8F细胞经不同干预的生长情况实验设6个组,每组设3个复孔,实验重复3次。在96孔板内按照5×103/孔的浓度分别接种细胞,具体细胞种类及相应处理如下:①对照组1(空白对照),CD133(+)5-8F细胞,不做任何干预。②对照组2,CD133(+)5-8F细胞加入GCV(GCV终浓度为1 mg/L,连续给药2d,下同)。③对照组3,CD133(+)5-8F细胞,加入TK-MSCs/GCV条件培养液(条件培养液即TK-MSCs加入1 mg/L的GCV培养48h的培养上清),条件培养液与原培养液的体积为1:1。④对照组4,CD133(-)5-8F细胞和TK-MSCs(两者各占混合细胞总数的50%,下同),加入GCV。⑤对照组5,未分选5-8F和TK-MSCs,加入GCV。⑥实验组,CD133(+)5-8F细胞和TK-MSCs,加入GCV。2d后用CCK-8试剂盒检测各组的450nm的A值,量化活细胞数,计算生存率。2.8 CD133(+)5-8F细胞和TK-MSCs的最适混合比例实验分6组,每组3个复孔,实验重复3次。按照5×103/孔的密度将CD133(+)5-8F细胞和TK-MSCs的混合细胞接种到96孔板,各组TK-MSCs细胞数量占混合细胞的比例分别为0%,5%,20%,40%,60%,80%,接种后第2天加终浓度为1 mg/L的GCV,另设不作处理的CD133(+)5-8F细胞为对照。连续2 d给予GCV后,用CCK-8试剂盒检测各组450nm的A值,量化活细胞数,计算生存率。2.9统计学分析应用SPSS 13.0软件进行统计学处理,结果以X± S表示。多个样本均数比较采用单因素方差分析;参数比较均先进行方差齐性检验,若方差不齐,用基于方差不齐的近似F检验Welch法;多重比较采用LSD(方差齐时)或Dunnett’s T3法(方差不齐时)。P<0.05为差异有显著性意义。结果1、MSCs的分离、培养和鉴定镜下观察MSCs为长梭形,形态与成纤维细胞相似,少量细胞呈扁平、星形。细胞表面标志鉴定可见MSCs阳性表达CD29(99.96%)和CD44(99.26%),阴性表达CD34(3.04%)和CD45(1.14%)。多分化潜能鉴定:成脂诱导培养经油红O染色显示有大量脂质沉淀;成骨诱导培养经茜素红染色见红色结节;成软骨诱导培养后细胞表面会变得光滑呈胶质,经甲苯胺蓝染色呈淡蓝色。MSCs增殖能力鉴定:第1天为潜伏期,细胞生长缓慢;第2～5天为对数生长期,细胞生长活跃;第6天以后进入平台期,细胞PDT为(31.7±0.5)h。2、pCDH-CMV-HA-TK-EF1-copGFP 载体构建重组载体构建后双酶切鉴定可看到预期的片段,大小约1161bp,与理论一致。测序结果发现一个同义突变点(G33T),编码的氨基酸均为丙氨酸,不影响蛋白表达,故无需处理。3、慢病毒制备及MSCs的感染成功制备高滴度的慢病毒液。MOI=50时重组慢病毒感染MSCs72h,不加助转染剂Polybrene时转染效率为(42.1±0.3)%;加入Polybrene时转染效率提高到(95.1±0.1)%。感染后进行RT-PCR实验:重组慢病毒感染的MSCs可以在1161bp处见一特异性条带,而未感染组则未见此条带。Western blotting结果显示,TK-MSCs组在42.6KD处见特异性条带,转染空载体组和未转染组则未出现,提示TA-TK蛋白成功表达。4、免疫磁珠分选CD133(+)5-8F细胞刚分选的CD133(+)5-8F细胞呈单细胞、悬浮生长,随着培养时间的延长细胞数量增多,形成细胞悬浮的球状细胞团。5、TK-MSCs的归巢性各组平均迁移细胞数的比较差异有显著性意义(F=541.802,P==0.000),方差不齐(P=0.000),多重比较采用Dunnett’sT3法。第1、2、3组肿瘤细胞对TK-MSCs有趋化作用(与第4组相比P值均为0.000);第1组迁移细胞数较第2、3组多(P值均为0.000),说明TK-MSCs对CD133(+)5-8F细胞有更强的迁移作用。6、CD133(+)5-8F细胞经不同干预的生长情况对照组1、2、3和实验组比较,F=792.711,P=0.000,方差齐(P=0.725),进一步采用LSD法多重比较:对照组2无明显杀伤作用(与对照组1空白对照比P=0.310);对照组3和实验组有杀伤作用(与对照组1空白对照比均有P=0.000);实验组杀伤作用较对照组3强(P=0.000)。对照组4、5和实验组比较,F=136.041,P P=0.000,方差齐(P=0.485),进一步采用LSD法多重比较:对照组4、5分别与实验组比较差异有显著性意义(P值均为0.000),提示TK-MSCs/GCV对CD133(-)5-8F细胞和未分选5-8F细胞的杀伤作用强于对CD133(+)5-8F细胞的杀伤作用。7、CD133(+)5-8F细胞和TK-MSCs的最适混合比例当TK-MSCs的比例分别为0%和5%时,细胞的生存率分别为98.4±3.1%和97.0±2.3%,细胞活性仍较高,旁观者效应不明显;当TK-MSCs的比例达到20%时,细胞生存率为68.2±2.3%,旁观者效应较明显(如无旁观者效应时生存率应≧80%),并且随着TK-MSCs的比例的增加,细胞毒性增强。结论1、采用密度梯度离心法可分离获得高纯度的MSCs,阳性表达CD29和CD44,阴性表达CD34和CD45。MSCs具有多向分化潜能,在相应的体外诱导培养条件下能分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞。2、成功构建慢病毒表达载体pCDH-CMV-HA-TK-EF1-copGFP,制备出高滴度的慢病毒并有效感染MSCs,转染效率可达95%,转染的TK-MSCs能有效表达HA-TK蛋白。3、可经CD133免疫磁珠分选鼻咽癌CD133(+)肿瘤干细胞。TK-MSCs对肿瘤细胞(尤其是鼻咽癌干细胞)具有归巢特性。TK-MSCs/GCV表现明显的旁观者效应,对CD133(+)5-8F细胞具有明显的杀伤效果。