网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）是一种禽反转录病毒,感染禽群后主要引起禽群严重的免疫抑制,导致继发感染和混合感染频发,给养禽业造成巨大的经济损失。因致病机制不明,目前尚无有效的防控措施。Exosome是活细胞分泌的一种细胞外囊泡,可参与体内多种生理及病理过程,通过蛋白质、m RNA、RNA、脂类等物质的交换在细胞间进行信息传递,在反转录病毒逃避免疫的复制过程中起到重要作用。本课题组前期实验也已证明REV感染细胞分泌的exosome不仅携带有病毒自身的重要成分,还可以对脾细胞的CD4+和CD8+T细胞产生明显的抑制作用,为病毒创造了一个免疫抑制的微环境,但REV如何利用exosome途径促进病毒增殖还需进一步研究。本课题组前期研究结果显示,RAB5b与REV的复制有着密切的关系,RAB5b是RAB5的亚型之一,可以促进细胞的内吞作用,早期内体融合以及囊泡运输,调节exosome的形成和分泌。结合实验室前期研究和RAB5b的功能,本研究推测REV能否通过RAB5b调控exosome途径促进病毒复制?本研究通过检测RAB5b对REV复制的影响;在REV感染细胞体系中,RAB5b对exosome分泌的影响,明确REV调控RAB5b促进自身复制的作用,为REV的致病机制研究提供科学基础和理论依据。本研究首先通过荧光定量PCR检测REV感染后12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、108小时DF-1细胞中RAB5b及REV的转录水平,结果显示RAB5b的转录水平随着病毒复制量的上升呈逐渐上升趋势,在病毒复制的不同阶段RAB5b与REV复制在体外感染模型中存在正相关关系。通过对SPF鸡腹腔注射REV建立体内感染模型,不同时间点剖杀,取各组织固定,制备组织病理切片并同时提取各组织RNA。观察组织切片病变证明攻毒模型构建成功且对机体造成损伤,随后荧光定量PCR检测证明随着病毒复制量的增加,RAB5b在各组织内的表达量均呈上升趋势,结果说明REV复制与RAB5b的表达在体内感染模型中存在正相关。为进一步检测RAB5b对REV复制的影响,构建RAB5b过表达稳转细胞株以及三条RAB5b干扰质粒,通过嘌呤霉素对RAB5b过表达稳转细胞株进行筛选,荧光定量PCR及Western blot检测筛选RAB5b过表达稳转细胞株后,REV接种RAB5b过表达稳转细胞株;通过荧光定量PCR和Western blot检测细胞中REV的转录水平,结果显示过表达RAB5b后相比空载组REV复制显著上升。三条RAB5b干扰质粒转染细胞,荧光定量PCR明确最佳RAB5b干扰质粒,最佳RAB5b干扰质粒转染细胞后接种REV,荧光定量PCR和Western blot检测接毒细胞中REV的转录水平,结果显示敲低RAB5b后与空载组相比,REV复制显著下降,以上结果说明RAB5b具有促进REV复制的作用。为进一步明确RAB5b对exosome的影响,差速离心法提取REV接毒后DF-1细胞上清中的exosome,BCA蛋白浓度测定及Western blot检测exosome标志蛋白TSG101,结果显示REV接毒可以促进细胞exosome的分泌。分别从过表达RAB5b和转染了RAB5b干扰质粒DF-1细胞上清中提取exosome,BCA蛋白浓度测定及Western blot检测exosome标志蛋白TSG101,结果显示过表达RAB5b相比空载可以促进细胞exosome的分泌,干扰RAB5b则抑制细胞exosome的分泌。REV编码的功能蛋白主要有gag、pol、env三种,为进一步明确REV调控RAB5b表达的病毒元件;构建了REV-gag、REV-pol、REV-env过表达质粒,荧光定量PCR检测确保质粒构建成功后,分别转染细胞后通过荧光定量PCR检测细胞内RAB5b的表达量,结果表明过表达gag蛋白显著促进了RAB5b的表达量。以上结果表明REV通过gag蛋白调节RAB5b促进exosome分泌。本研究通过建立体内外REV感染模型,构建RAB5b过表达稳转细胞株和抑制RAB5b表达的sh RNA干扰质粒,证明了RAB5b促进REV的复制以及细胞exosome的分泌;构建REV不同病毒元件过表达质粒,证明REV通过gag蛋白正向调节RAB5b的表达。本实验为进一步深入研究REV的致病机制提供了新的科学基础和理论依据。