【摘 要】
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目的:通过山羊支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp）感染山羊气管上皮细胞,建立感染方法,可用于实验室鉴定Mccp潜在保护性抗原,为潜在保护性抗原靶标鉴定提供技术手段,为Mccp致病机理研究奠定基础;建立Mccp感染SPF鸡胚的方法,评价Mccp不同菌株毒力,为疫苗用菌株的筛选提供可靠的评价方法。方法:（1）Mccp感染
【基金项目】
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2017年国家重点研发计划项目—《牛羊重要疫病免疫防控技术研究》（No:2017YFD05009052020）； 重要羊支原体病防控技术新产品创制与应用—《家畜疫病病原微生物学国家重点实验室重大成果培育》（No:SKLVEB2016CGY04）； 甘肃省自然科学基金项目—《山羊支原体山羊肺炎亚种生物被膜与浮游细胞免疫蛋白组
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目的:通过山羊支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp）感染山羊气管上皮细胞,建立感染方法,可用于实验室鉴定Mccp潜在保护性抗原,为潜在保护性抗原靶标鉴定提供技术手段,为Mccp致病机理研究奠定基础;建立Mccp感染SPF鸡胚的方法,评价Mccp不同菌株毒力,为疫苗用菌株的筛选提供可靠的评价方法。方法:（1）Mccp感染山羊气管上皮细胞（GTC）间接免疫荧光（IFA）试验:用Mccp感染GTC细胞,Mccp感染山羊康复后血清作为一抗,FITC标记的兔抗山羊Ig G为二抗,确定Mccp感染浓度、时间及一抗、二抗工作浓度;建立间接免疫荧光检测方法（IFA）。（2）Mccp感染GTC间接免疫荧光方法的初步应用:使用实验室制备的阳性血清、阴性血清,以及实验室前期反向疫苗学和免疫蛋白组学筛选的与Mccp黏附相关蛋白P161、P87、P42、P200R1、P200R2所制抗血清和混合抗血清与Mccp菌液共孵育,接种GTC细胞,观察特异性荧光强度变化,并用real-time PCR检测各血清与Mccp菌液共孵育后黏附细胞菌量拷贝值,计算黏附率,鉴定这些蛋白对Mccp黏附GTC细胞的阻断/黏附作用,为疫苗研制提供可用的潜在保护性靶标。（3）Mccp感染SPF鸡胚方法的建立及初步应用:使用不同浓度（剂量:0.2 m L/蛋）Mccp菌液通过鸡胚卵黄囊和尿囊腔途径,感染不同日龄SPF鸡胚,观察并记录鸡胚死亡情况。采集鸡胚尿囊液和卵黄囊液样品进行Mccp real-time PCR鉴定和分离培养鉴定,确定Mccp感染鸡胚最适接种浓度（剂量:0.2 m L/蛋）、接种途径和接种日龄,以及real-time PCR检测和分离培养最佳样品,建立Mccp感染鸡胚方法。利用该方法,将Mccp M1801分离株、M1601分离株、F38标准株和从藏羚羊上分离的ZLY 1309F株接种同一日龄SPF鸡胚,统计鸡胚死亡率、real-time PCR检测样品阳性率和样品分离培养鉴定阳性率,比较4株Mccp菌株对鸡胚致病力强弱。结果:（1）Mccp感染GTC细胞间接免疫荧光方法条件为:黏附滴度为1.5～7.0×107copies/μL（1×106CCU/m L,剂量:0.2 m L/蛋）,黏附时间为2 h,一抗最适工作浓度为1:100,二抗最适工作浓度为1:100。阳性血清阻断Mccp黏附作用,可观察到荧光亮度减弱和黏附率降低。（2）Mccp感染山羊气管上皮细胞（GTC）间接免疫荧光（IFA）方法的初步应用:阳性血清处理Mccp菌液黏附细胞后特异性荧光几乎没有,其黏附率（0.23%和0.27%）相比较阳性血清（黏附率为7.96%和8.58%）也明显下降;P161抗血清、P87抗血清、P42抗血清、P200R1抗血清、P200R2抗血清、混合抗血清阻断孔特异性荧光强度均减少,其中P161荧光减少最明显。各蛋白阻断黏附后黏附率降低由强到弱为P161抗血清（黏附率为1.64%和1.76%）、混合抗血清（黏附率为1.07%和1.47%）、P200R2抗血清（2.03%和2.48%）、P200R1抗血清（黏附率为2.06%和2.65%）、P87抗血清（黏附率为2.28%和2.96%）、P42抗血清（3.44%和4.13%）。从特异性荧光减少和黏附率观察,推测蛋白P161与Mccp黏附密切相关。（3）建立Mccp感染SPF鸡胚试验方法最优条件为:卵黄囊途径接种,接种浓度为1×107CCU/m L（剂量:0.2m L/蛋）,接种日龄为7～8日龄,尿囊液为最佳real-time PCR检测和分离鉴定样品。用该方法比较可知M1801株死亡率、real-time PCR检测样品阳性率和样品分离鉴定阳性率均为100%,为4株Mccp中致病力强毒株;M1601（死亡率60%,检测阳性率100%,分离鉴定阳性率50%）次之,最后是F38株（死亡率30%,检测阳性率90%,分离鉴定阳性率70%）和ZLY 1309F株（死亡率30%,检测阳性率100%,分离鉴定阳性率70%）。结论:（1）建立了Mccp黏附GTC细胞的IFA方法,且阳性血清阻断该黏附作用。（2）初步鉴定Mccp P161蛋白具有黏附作用。（3）建立了Mccp感染鸡胚方法,可用于Mccp菌株毒力评价。
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